Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
случае неспецифического включения фермента в гель в дополнение к
связыванию фермента с помощью лиганда, сопровождающемуся образованием
комплекса, Грейвс и By получили следующее выражение;
Связанный фермент + Включенный фермент V (?0 - Е) ^
Весь фермент VE0
Ци________________, ( у \
Кь (V 4- а) + Lav [ V + v J
1-
/(L(r+4)+V ' (3'9>
Это отношение показывает распределение фермента между двумя фазами, а
различие между уравнениями (3.9) и (3.8) обусловлено ферментом,
включенным в гель дополнительно к комплексу с лигандом.
Из уравнения (3.9) следует
Свободный фермент + Включенный фермент _____ (F -(- е) Е
Связанный фермент (Е0) V - Е (V -J- v) ~
^ v f , Kl ( V + V
¦?-+тр{^)- (ЗЛ0)
График зависимости левой части уравнения (3.10) от Ер- прямая. Определив
тангенс угла наклона этой прямой V/(L0v),
24
Глава 3
можно найти Lq. Пересечение прямой с осью ординат дает величину
/Сь(У+и)/(?-оу), откуда можно найти Kl-
Возвращаясь к уравнению (3.8) и принятым при его выведении приближениям
(общее число молей фермента EqV много меньше общего числа молей лиганда
L0o) и вводя дополнительное
Рис. 3.3. Доля связанного фермента при низких концентрациях фермента,
согласно уравнению (3.11). Этот общий гиперболический график может быть
также приложим к более точному уравнению (3.8) и даже для оценки доли
насыщения лиганда [3]. •
ограничение У"С", можно исключить из уравнения Eq, V и v и получить
следующее простое соотношение:
Связанный фермент . L" ,,, j j.
Весь фермент /CL -j- Z.0 '
Из последнего соотношения видно влияние изменений Kl и Lq па
эффективности связывания фермента; их взаимная зависимость иллюстрируется
рис. 3.3. Полученные кривые представляют собой прямоугольные гиперболы,
подобные изотермам насыщения Ленг-мюра или уравнению Михаэлиса - Ментен.
Из рис. 3,3, например, следует, что при обычной концентрации лиганда (10
ммоль/л) достаточно эффективное связывание фермента происходит при
¦Kl^IO-3 моль/л, в то время как при более высоких значениях Kl фермент
удерживается плохо. К подобным же выводам пришли также, например, Стире и
др. [15] на основании экспериментальных результатов. Однако следует
подчеркнуть, что рассматривается комплекс фермента с лигандом, ковалентно
связанным с нерастворимым носителем, поэтому значения Kl не обязательно
согласуются с величинами констант равновесия, определенными в растворе.
На рис. 3.4 приведена зависимость количеств связанной лак-
татдегидрогеназы из скелетных мышц кролика и мышц сердца свиньи и
глицерокиназы от концентрации М6-(6*аминогексил)-5'-
Теория аффинной хроматографии
Т.
ДМР на сефарозе [4]. Связаны ли наблюдаемые различия в ходе этих кривых с
различиями констант равновесия для образования индивидуальных комплексов,
к сожалению, не известно автору этой книги; однако, судя по концентрациям
растворов хлорида калия, необходимых для элюирования каждого фермента с
упомянутого нуклеотидного носителя, связывание глицерокиназы слабее
лактатдегидрогеназ {табл. 4.2).
[Лиганд], ммоль/мл
Рис. '4.4. Ёмкость сорбента с иммобилизованным нуклеотидом (NM-6-
аминогек-сил) 5'-АМР-сефароза) в зависимости от концентрации лиганда [4].
Обр:мсц (]00 мкл) фермента (5 Е) н бычьего сывороточного альбумина (1.5
мг) ианоснлк колонку (50X5 мм), содержащую 1.0 г аффинного сорбента,
разбавленного до необходимой конц! щрации лиганда сефарозой 4В. / -
лактатдегкдрогеназа hi скелетных мышц кролика: 2 - лактатдегидрогеназа из
мышц, сердца свиньи; 3 - глицерокиназа.
Доля общего количества лигандных групп, которые в данных условиях
насыщаются молекулами фермента, выражается отношением EL/L0> которое
может быть получено, если обе части уравнения (3.7) разделить на L0. Если
на рис. 3.3 Ц по оси абсцисс заменить на EqV, а вместо Kl в качестве
переменного параметра использовать выражение Kl(V+у) +Lav, то отношение
EL/L0 определяет ординату.
В табл. 3,1 приведен процент насыщения лиганда молекулами фермента для
различных значений со {ш=Е/ц) в предположении, что Z,o=0,01 моль/л.
Насыщение молекул лиганда ферментом очень низко. Следовательно, при
хроматографии на аффинном сорбенте можно ожидатв, что фермент начнет
вытекать из колонки значительно раньше насыщения реактивных групп геля.
Истинная емкость аффинного сорбента далека от соответствия количеству
лиганда, связанного с гелем, которое может быть определено, на-
26
Глава 3
Таблица ЗА
Процент насыщения аффинного лиганда в различных условиях (i-a = 0,01
МОЛЬ/Л)
?'о, моль/л моль/л - EL/Lо, %
ш = 1 и = 10 100
10-4 10-3 0,8264 4,5455 8,2645
10-4 0,9709 8,2645 33,2226
10-6 0,9881 9.0009 47,5964
ю-в 0,9899 9,0818 49,7488
10-ь 10-3 0,0833 0,4739 0,8929
10-4 0,0979 0,8929 4,7393
10-6 0,0997 0,9794 8,3264
10-6 0,0999 0,9890 9,0082
10-4 Ю-з 0,0083 0,0476 0,0900 -
10-4 0,0098 0,0900 0,4950
10-6 0.0100 0,0988 0,9001
10-6 0,0100 0,0998 0,9803
ю-7 Ю-з 0,0008 0,0048 0,0090
10-4 0,0010 0,0090 0,0497
10-6 0,0010 0,0099 0.0907
10-6 0,0010 0,0100 0,0989
