Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
выделения антител на колонке с целлюлозой с ковалентно присоединенным
антигеном. Для выделения ферментов аффинная хроматография впервые была
применена в 1953 г. Лерманом [15], который выделил тирозиназу на колонке
с целлюлозой, эфирно связанной с остатками резорцина. В последующие годы
аффинная хроматография использовалась весьма редко, что; очевидно, об-
16
Глава 2
условлено свойствами известных в то время нерастворимых подложек, которые
ограничивали возможности образования комплексов между выделяемыми
продуктами и присоединенными аф-финантами. На подложках с гидрофобными
или ионогенными группами часто наблюдалась носпецифическая сорбция.
Однако в последние несколько лет наблюдается широкое развитие метода.
Толчком послужило открытие Поратом и сотр. [2, 3, 18] присоединения
аффинанта к агарозе, активированной бром-
Рис. 2.1. Схема биоспецнфической адсорбции (Л), элюирования
"деформирующим" буферным раствором (?) и биоэлкшровання растворимым
конкурентным лигандом (В) [17].
Инг - иммобилизованный ингибитор; L - конкурентный лиганд,
цианом. Куатреказас и Анфинсен [7] показали, что агароза (наиболее
распространенная продажная форма сефарозы) обладает почти всеми
характеристиками идеального носителя, В 1968 г. Куатреказас и др. [8]
успешно применили аффинную хроматографию для выделения нуклеазы,
химотрипсина и карбоксипепти-дазы А и предложили термин "аффинная
хроматография". Далее развитие метода шло в основном в направлении его
применения для выделения ферментов, их ингибиторов, антител и антигенов,
нуклеиновых кислот, транспортных и репрессорных белков, гормонов и их
рецепторов и др. (см. табл. 11.1).
Использование аффинной хроматографии тем не менее не ограничивается
только выделением биологически активных веществ. Уже в 1960 г. Яги и др.
[22] описали определение небольших количеств антител с помощью
нерастворимых носителей с привязанными антигенами. Применение
нерастворимых носителей в количественном радиоиммунном анализе детально
рассмотрено в разд. 11.7. Иммобилизованные олигомеры политимидиловой
кислоты использовали Эдмондс и др. [11] для количественного определения
полиадениловой кислоты. Аффинная гель-фильтрация как микрометод при
экспрессных определениях молекулярных масс
Принцип метода, историческая справка и применение
17
дегидрогеназ основана на исключении последних из гелевой среды с
варьируемым размером пор; метод описан Лоу и Дином [16].
По своей сути аффинная хроматография - идеальный метод для изучения
взаимодействий в биохимических процессах. Иммобилизованная лейцил-тРНК-
синтетаза использована как для выделения изолейцил-тРНК, так и для
изучения взаимодействия белка с нуклеиновой кислотой [10]. Взаимодействия
пептидов с белками [12] и нуклеотидов с аминокислотами и пептидами [20]
05ът эяюата. мл
Рис. 2.2. Элюирование изоферментов лактатдегидрогеназы вогнутым
градиентом NADH [4].
0,2 мл образца белка (0,2 мг] в растворе, содержащем 0.1 М Na-фосфатнып
б>фор (pH 7.0). 1 мМ р-меркяптоэтанол и 1 М хлорид натрия, нанесены не
колонку с *.vi|ijpn-зой со связанным аналогом АМР <140x6 мм, содержащую
2,5 г влажного геля), уравновешенную 0.1 М Na-фосфатным буфером {pH 7,5);
затем колонка промыта 10 мл используемого буферного раствора, изоферменты
элюированы вогнутым градиентом NADH (от 0,0 до 0.; ммоль/л) в буферном
растворе 1 мМ Р-меркаптоэтанола. Объем фракции 1 мл;
скорость потока 3,4 мл/ч.
также изучены этим методом. Кроме того, метод применен для исследования
механизмов ферментативных процессов и выяснения структур молекул. Аканума
и сотр. [1] применили его для изучения связывающего участка бычьей
карбокеипептидазы В, исследуя комплексообразовапие с иммобилизованными
субстратными аналогами основных и ароматических аминокислот. Используя
аффинную хроматографию, Дилени и О'Карра [9] показали, что оксалоацетат
ингибирует лактатдегидрогеназу путем образования тройного непродуктивного
комплекса с комплексом фермент - NAD+, а не с комплексом фермент - NADH,
как предполагалось первоначально. Аффинная хроматография оказалась весьма
полезной при изучении кинетики активации трипсиногена [14]. Молекулярная
структура интерферонов фибробластов и лейкоцитов
2-6
18
Глава 2
человека изучена с помощью аффинной хроматографии Янковским и др. [13].
Для разделения изоферментов лактатдегидрогеназы Броделиус и Мосбах
использовали сефарозу с присоединенными аналогами АМР; при элюировании
растворами с возрастающей концентрацией NADH получены пять пиков
изоферментов (рис. 2.2). Разделение достигается благодаря различиям в
константах диссоциации /Сдисс двойного комплекса фермент - NADH. Позднее
Броделиус и Мосбах [5] аналогичным образом хроматографиро-
1 I_________| |__________j___________|
о 0,1 0J2 0,3 0,4
Элюирующая концентрация NADH, ммоль/л
Рис. 2.3. Зависимость константы диссоциации бинарных комплексов фермент -
NADH [5].
Лактатдегидрогеназы: 1 - Н< быка; 2 - Н< сниньи;
3 - М* быка; 4 - М* кролика; 5 - SU
