Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
достойные исследования. Исходя из теоретической и практической значимости
полезно знать пространственное распределение ковалентно связанных
биологически активных молекул.
Наиболее часто применяемым методом является флуоресцентная микроскопия,
молекулы белка метятся флуоресцеинизотиоциа-натом и становятся благодаря
этому "видимыми" [22, 45, 60]. Для того чтобы сделать видимой
лейцинаминопептидазу, связанную с сефарозой или сефадексом, Лаш и др.
[45] использовали две методики. Согласно одной методике, флуорохромный
флуоресцеинизо-тиоцианат ковалентно связывался с белком перед его
присоединением к нерастворимому носителю, согласно другой - антитела к
ферменту метились производным флуоресцеина.
Фермент метят флуорохромныы флуоресцеинизотиоцианатом путем дналнза при
энергичном перемешивании при 4°С в течение 8 ч 2 мл 13,8 мкМ раствора
фермента против 257 мкМ раствора флуоресцеинизотиоцианата. Оба раствора
готовят в 0,1 М бикарбонате натрия. После диализа смесь наносят на
колонку с сефадексом G-25. Фермент, меченный флуоресцеииом, проходит
через колонку без задержки и почти без разбавления, в то время как
флуоресцеинизотиоциа-нат сильно адсорбируется гелем. Он может быть
частично элюирован пятикратным (относительно объема колонки) объемом 0,1
И бикарбоната натрия.
Антисыворотку к лейцинаминопептидазе метят таким же способом.
Связывание фермента, меченного флуоресцеииом, на активированных
бромцианом сефарозе или сефадексе осуществляют аналогично связыванию
немечен-ного фермента. Меченные флуоресцеииом антитела связывают на
ферменте, иммобилизованном на матрице, из 0,1 М раствора бикарбоната
иатрия. Неразбавленную меченую антисыворотку смешивают с равным объемом
суспензии фермента, связанного с нерастворимым носителем, и
термостатируют 1 ч при 37 °С и еще 12 ч при 4°С. После перенесения
материала на стеклянный фильтр неспе-цифическн сорбированные компоненты
удаляют интенсивным промыванием 0,1 М бикарбонатом натрия.
Для определения распределения белка внутри гранул носителя готовят тонкие
срезы носителя с прикрепленным ферментом, принимая меры предосторожности
против нарушения структуры матрицы. Для этого гранулы носителя включают в
20%-ную желатину. Частицы геля выдерживают б ч при 37 °С в растворе
желатины, затем смесь переносят в подходящий для этих целей небольшой
контейнер н оставляют на несколько часов в холодильнике. Желатиновые
блоки замерзают, их режут микротомом на образцы толщиной 10 мкм.
Полученные срезы наносят на предметные стекла и покрывают тонкими
покровными стеклами для предохранения от высыхання. С помощью
флуоресцентного спектрофотометра записывают спектры поглощения и
излучения флуоресцеинизотиоцианата меченной флуоресцеииом амннопептидазы,
как свободной, так и связанной с агарозным или декстриновым носителем.
256
Глава 9
В работах с мечением белков флуоресцеином для их обнаружений показана
однородность распределения белков в геле. Однако Дэвид и др. [15],
которые исследовали распределение белка методом радиоавтографии 1гв1-
меченой пероксидазы, связанной с сефарозой, не обнаружили связывания
фермента внутри гранул сефарозы. Лаш и др. [46] нашли, что расхождения
объясняются не методами обнаружения белка, а разными методами его
иммобилизации. Используя электронную микроскопию ферритина, связанного с
сефарозой, они продемонстрировали, что использование одень эффективного
метода связывания, а именно большого избытка ферритина в ходе связывания
(>50 мг/мл), с эффективностью связывания >90% приводит к вогнутой кривой
распределения ковалентно связанного ферритина, в то время как при
эффективности связывания >50% наблюдается снова однородное распределение
связанного ферритина.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ахёп R., Ernback S., Eur, J. Biochem., 18, 351-360 (1971).
2. Barel A. 0., Prieels J. P., Eur. J. Biochem., 50, 463-473 (1975).
3. Barel A. O., Rocsens H., Anal. Biochem., 60, 505-511 (1974).
4. Barker R" Olsen. K. W., Shaper J. H., HiU R. L" J, Biol. Chem., 247,
7135-
7147 (1972).
5. Bartett G. R., J. Biol. Chem., 234^466-468 (1959).
6. Benko B., Vuk-Pavlovic S., Dezelic G., Mericlc S., J. Colloid
Interface Sci., 52, 444-451 (1975).
7. Berglund 0" Eckstein P., Eur. J. Biochem., 28, 492-496 (1972).
8. Berliner L. J., Milter S. Т., Uy R., Royer G. P., Biochim. Biophys.
Acta, 315,
195-199 (1973).
9. Borchardt R. Т., Cheng C., Thakker D. R., Biochem. Biophys. Res.
Comm,, 63, 69-77 (1975).
10. Brenna О., Pace М., Pietta P. G., Anal. Chem., 47, 329-331 (1975).
11. Chase Т., Jr., Shaw E., Biochem. Biophys. Res. Comm., 29, 508-514
(1967).
12. Collier RKohlhaw G., Anal. Biochem., 42, 48-53 (1971).
13. Craven D. B., Harvey Af. J., Lowe C. R., Dean P. D, G., Eur. J.
Biochem., 41, 329-333 (1974).
14. Cuatrecasas P., J. Biol. Chem., 245, 3059-3065 (1970).
15. David G. S., Chino Т. H" Resifeld R. A., FEBS Lett., 43, 264-266
(1974).
16. Dubois Af., Gilles K- A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith P.,
