Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
специфическим сорбентом является наиболее важным моментом при выделении
высокомолекулярных веществ, в особенности если они присутствуют в высоких
концентрациях. Скорость потока, концентрация наносимого образца и время
уравновешивания обсуждались в разд. 5.4.
Концентрация выделяемого вещества в сорбируемом растворе влияет на
скорость достижения равновесия главным образом при сорбции в статических
условиях. На рис. 10,4 показаны ориентировочные опыты, проведенные
Поратом и Сандбергом (см. в [32]). Порции (по 1 г) сефарозы с
прикрепленным соевым ингибитором трипсина встряхивались с растворами,
содержащими равные количества трипсина, но отличающимися по концентрации;
измерялась остаточная активность трипсина через различные интервалы
времени. Анализ полученных результатов позволил сделать вывод, что для
суспензии, содержащей 1% частиц адсорбирующего 6%-ного (или менее
сшитого) геля диаметром 50-100 мкм, в растворе, содержащем выделяемое
вещество молекулярной массы 10 000-100000, для сорбции необходимое время
контакта с веществом составляет 20-30 мин. Объемистые белковые молекулы
или частицы размером >106 дальтон требуют более продолжительного времени
для диффузии к связывающим участкам аффин-
266
Глава 10
ного лиганда даже при использовании геля с высокой проницаемостью. Для
веществ с гигантскими молекулами, чтобы процесс сорбции не зависел от
проникновения их в гель, наиболее подходящим сорбентом является сорбент в
форме шариков, покрытых веществами, которые специфически взаимодействуют
с данным высокомолекулярным веществом.
Сорбция в статических условиях особенно пригодна при выделении очень
больших количеств веществ, если участвующие системы обладают достаточно
высоким сродством. Часто полезно перед специфической сорбцией ввести
предварительную стадию очистки, для того чтобы диссоциировать и отделить
компоненты, находящиеся обычно в виде комплексов, содер-
жащих требуемые вещества. Эта стадия может включать, например, осаждение,
экстракцию или сорбцию на ионообменнике. Часто аффинную сорбцию проводят
непосредственно из неочищенных экстрактов, сыворо-Рис. 10.4. Скорость
адсорбции трипсина на так или экссудатов. Порат
частицах препарата соевый ингибитор трип- и Кристиансен Г321 реко-
сина-агароза^в суспензиях различной кон- мендуют специфические сор-
бенты в виде геля помещать в контейнеры с полупроницаемыми стенками,
через которые могут свободно проходить растворенные вещества, но
задерживаются крупные частицы. Например, этими сорбентами можно наполнять
мешочки из найлоновой сеточки. При погружении в среду нескольких
мешочков, содержащих различные специфические сорбенты, можно одновременно
выделить несколько веществ или же удалить из раствора нежелательные
вещества, такие, как протеолитические ферменты, которые могут понижать
выходы выделяемых веществ.
10.2. УСЛОВИЯ ЭЛЮИРОВАНИЯ
Теоретические рекомендации для освобождения выделяемых веществ из
специфических комплексов с иммобилизованными аффинными лигандами
обсуждались в разд. 3.1. В то время как вещества, которые не обладают
сродством к присоединенному аффинному лиганду, обычно элюируются
удерживаемым объемом
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
267
элюента, специфически сорбированный материал большей частью можно снять с
помощью специфического элюирующего агента или путем изменения температуры
или состава растворителя.
10.2.1. Практические указания для проведения десорбции
Биоспецифическое элюирование конкурентными ингибиторами применяется при
выделении химотрипсина и трипсина из панкреатических экстрактов с помощью
аффинной хроматографии на ага-
Рис. 10.5. Аффинная хроматография панкреатического экстракта на колонке с
6%-ной агарозой со связанным соевым ингибитором трипсина. Ступенчатое
элюирование осуществлялось специфическими ингибиторами [31].
розе с присоединенным соевым ингибитором трипсина (рис. 10.5):
химотрипсин вытесняется раствором триптамина, а трипсин - раствором
бензамидина [31]. Такое элюирование является примером постадийного
элюирования.
Пример градиентного элюирования специфическим элюентом приведен на рис.
10.6: нативный лизоцим, специфически сорбированный на три-(Ы-
ацетилглюкозамин) -сефарозе, элюируется концентрационным градиентом три-
(М-ацетилглюкозамина), различной крутизны [7]. Концентрационный градиент
специфически элюирующего реагента всегда задавался после поомывки
исходным буфером. Количество наносимого на колонку фермента, параметры
колонки, состав буфера и другие условия были одинаковыми для трех
разбираемых случаев. Отличались только скорости изменения концентрации
три-(Ы-ацетилглюкозамина), как это видно из рисунка. Выходы белка
составляли приблизительно 90%. Лизоцим
268
Глава 10
был элюирован при всех трех градиентах при концентрации три-(N-
ацетилглюкозамина) 5• 10-6 моль/л, что согласуется с константой
ассоциации для связывания три-(N-ацетилглюкозамина) ли-
ЗОЦИМОМ (Аасс = 10S Л/МОЛЬ).
