Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
переворачивают реактор на короткое время, чтобы удалить из него воздух,
и, наконец, повышают скорость циркуляции до 10 мл/мин. На рис. 9.4
показано увеличение светопоглощеиня в результате "выброса" н последующий
после "выброса" гидролиз, записанные на диаграммной ленте самописца.
Раствор содержит большой избыток НФГБ относительно стехиометрического
количества; наблюдаемые на начальном участке диаграммы колебания
объясняются небольшой "пробкой" re-нитрофенола в результате быстрой
реакции приблизительно стехиометрического объема раствора т.итранта с
ферментом, когда этот раствор проходит через реактор. Осцилляции быстро
демпфируются, когда "пробка разбивается", и концентрация n-нитрофеиола во
всей системе становится постоянной. "Выброс" определяется путем простой
экстраполяции начальной и последующей кинетических кривых гидролиза к
началу контакта фермента и титранта.
Жидкость выкачивают из системы и ее объем точно замеряют.
Иммобилизованный фермент аккуратно удаляют из реактора, высушивают при 90
°С н взвешивают. Содержание с молен активного трипсина (мкмоль/r) в
стекле может быть рассчитано по следующему уравнению:
с = 106ДЛи/е410шй, ' (9.1)
где Д-4 - оптическая плотность "выброса"; о (мл)-общий объем жидкости;
в41п-коэффициент экстинкции ге-нитрофенола (1,66 • 101 л-моль_1-см-1);
w (мг) -масса стекла; Ь (см)-толщина кюветы. Из рис. 9.4 видно, что
252
Глава 9
оптическая плотность "выброса" составляет 0,0265 ед., о=5,1 мл,
содержание активного трипсина в стекле 0,13 мкмоль/г.
Увеличение концентрации НФГБ в 5 раз не влияет на "выброс". Исключение
диметилсульфоксида также не сказывается на результатах.
Рис. 9.4. Диаграмма титрования активного центра [231.
62,1 иг стеклянных частиц диаметром 35 мкм со связанный трипсином
титровали 5,1 ил 0.03 мМ л-ннтрофеннлового эфнра л'-гуанндннобензойной
кислоты в 50 мМ веро-наловон буфере (pH 8,3), А - выключение насос л; В -
подключение реактора к системе; В - повторное включение насоса; "выброс"
соответствует оптической плотности 0,0265 ед.
Титрование активного центра химотрипсина, ковалентно связанного с
сефадексом G-200, описано Гейблом [25], который в качестве титрующего
агента использовал 4-метилумбеллиферил-и-<>"',М,]М-
триметиламмоний)циннамат (МУТМАЦ). Этот флуороген-ный титрующий активные
центры реагент позволяет определять даже 0,02 нмоль фермента.
МУТМАЦ (100 мкл 0,2 мМ водного раствора) добавляют к 2 мл 0,1 М боратного
буфера (pH 7,5), помещенных в кювету спектрофлуориметра, и записывают
базовую линию. Суспензию (50-200 мкл) тщательно размешанного сефа-декса
со овязанным хнмотрнпсияом вносят при перемешивании в кювету,
перемешивание продолжают еще 30 с. Записывают кривую флуоресценции
освобождающегося 4-метилумбеллиферона; она достигает постоянного значения
через .1 мин. Отсюда рассчитывают концентрацию активных центров.
Вычисленная концентрация активного фермента не зависит от объема
суспензии и количества МУТМАЦ и становится постоянной после перемешивания
в течение 15 с-1 мни.
Для протеиназ, активность которых определяется единственной титруемой SH-
группой, например для протеиназы из Steptococcus, можно использовать для
титрования активных центров 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойную кислоту)
(см. разд. 9,2.11).
9.5. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БЕЛКОВ
Изменения в поведении аффинных лигандов после их связывания с
нерастворимым носителем большей частью объясняются
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов
253
модификацией при связывании, влиянием нового микроокружения, диффузионным
лимитированием и т. п. Реже предполагается, что такие изменения
обусловлены конформационными факторами, несмотря на то что по сравнению с
нативными ферментами устойчивость аффинных лиганов к тепловой инактивации
или денатурирующим агентам явно указывает на конформационные изменения
или предрасположенность к таковым в результате связывания фермента с
носителем. Среди различных физико-химических методов, разработанных для
исследования конформации белков в растворе, наиболее легко приложимым для
конформационных исследований иммобилизованных белков является, по-
видимому, флуоресцентный метод, для которого и интенсивность, и характер
спектра зависят от окружения флуоресцирующих групп и реагируют на
изменения этого окружения.
Сильное светорассеяние, обусловленное матрицей, может затруднять
измерения. Однако концентрация белков в иммобилизованных ферментах
достаточно высокая. Следовательно, оптическая плотность растворов белков
в области полос поглощения, как правило, высока. Таким образом,
поглощение света эффективно конкурирует со светорассеянием. При
возбуждении свет поглощается очень тонким слоем поверхности конъюгата
белок - матрица, и поэтому флуоресценцию следует наблюдать с фронтальной
части поверхности носителя с иммобилизованным белком. Кроме того,
поскольку излучение имеет большую длину волны по сравнению с длиной волны
