Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Очень выгодное с теоретической точки зрения элюирование конкурентным
аффинным лигандом имеет, однако, много практичес-
§
$
о
<Д
Объем элюирования, мл
Рис. 10.6. Влияние изменяющегося градиента три-(N-ацетилглюкозамина)
(GlcNAc)s на элюирование нативного лизоцима с три-(N-ацетилглюкозамин)-
сефарозы [7].
15 мг нативного белка в I мл исходного буфера <0,1 М ацетат аммония, pH
7,0) было нанесено на колонку (260К17 мм). Градиенты накладывались после
промывания колонки -5 объемами колонки <5X35 мл) исходным буфером, а
заканчивались 0Р1 мМ (GlcNAc)a з исходном буфере, Градиенты были
образованы с использованием: / -100 мл исходного буфера н
100 МЛ конечного буфера; 2 - 200 н 200 мл; 3 - 300 и 300 мл. Скорость
потока 23 мл/ч [7]*
ких ограничений, обусловленных главным образом их трудной доступностью н
высокой ценой. Например, лактатдегидрогеиазы могут быть элюированы с N6-
(6-аминогексил)-5'-АМР - агарозы относительно высококонцентрированным
раствором конкурентного лиганда NADH (1,5 ммоль/л) или раствором хлорида
калия средней концентрации (0,13 ммоль/л). Поэтому элюирование
адсорбированных веществ путем изменения температуры, pH или ионной силы
раствора используется наиболее часто.
Применение линейного градиента температуры для разделения смеси дрожжевой
алгокольдегидрогеназы, глицерокиназы, гексоки-назы и лактатдегидрогеиазы
аффинной хроматографией на N6-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозе [15]
показано на рис. 10,7. Интересно, что глицерокиназа и дрожжевая
алкогольдегидрогеназа элюируются в порядке, предсказываемом на основе их
наблюдаемых энергий адсорбции с высоким выходом (70-90%), в то время как
лактатдегидрогеназа требует ударного элюирования 5 мМ
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
269
NADH даже при 40 °С. Следовательно, слабо связанные ферменты можно
успешно элюировать температурным градиентом. Преимущество такого
элюирования состоит в том, что элюируемые ферменты не загрязняются
элюирующими реагентами (солями, нуклеотидом) и могут быть сразу
использованы для кинетических исследований. Для прочно связанных
ферментов температурный градиент можно применять в комбинации с другими
влияющими на
I
Рис. 10.7. Разделение смеси ферментов на Ыа-(6-амнпогексил)-5/-АМР-
сефарозе с помощью градиента температуры [15].
Образец (100 мкл), содержащий 5 Е каждого фермента и бычий сывороточный
альбумин (1.5 мг), наносили на колонку (50X5 мм), содержащую 0,5 г
ЫМб"амииогексил)-5/*АМР-се-ф а розу (1,5 мкмоль/мл АМР) при 4,7 °С.
Колонка уравновешивалась при наждой температуре н течение 5 мин перед
элюированием 1,6 мл уравновешивающего буфера; 10 мМ глице-рин+5 мМ MgCU+E
мМ ЭДТА+0,02% азид натрия-ИО мМ. трицин+КОН (pH 7,5). Момент введения
"ударного" количества (200 мкл) 5 мМ NADH в уравновешивающем буфере
указан стрелкой. Бычий сывороточный альбумин выходил с начальными
промывками колонки (0-4 мл). В элюате были обнаружены; 1 - гексокиназа; 2
- глнцерокиназа; 3 -дрожжевая алкогольдегидрогеназа; 4 -
лактатдегндрогеназа. Градиент температуры (5) получали ручной доводкой
циркулирующего нагревательного иасоса Черчилля.
удерживание вещества факторами, такими как сорбция при низких
концентрациях лигандов, ударное элюирование NADH или градиент ионной
силы.
Примером использования градиента pH является разделение смеси
никотинамиднуклеотид-зависимых дегидрогеназ на N6-(6-аминогексил)-5'-АМР
- сефарозе (рис. 10.8) [25]. Элюирование градиентом pH также позволяет
получить фермент, свободный от нуклеотида и подходящий, следовательно,
для использования в дальнейшем в кинетических исследованиях.
Пример использования линейного концентрационного градиента соли для
выделения РНК-полимеразы из Escherichia coti на ДНК-агарозе [29] показан
на рис. 10.9. Из фракции РНК-полимеразы, выделенной в результате
предварительной стадии очистки хроматографией на биогеле А, неактивный
материал отделяется аффинной хроматографией в виде первого пика, далее
линейным
270
Глава 10
концентрационным (0,25-1,25 моль/л) градиентом хлорида калия выделяются
две различные РНК-полнмеразы,
Десорбция папаина с агарозы со связанным глицилглицил-О-бензнл-Ь-тирозил-
О-аргинином является примером элюирования путем понижения ионной силы
элюирующего буфера. Бламберг и др. [5] извлекли папаин из его
специфического комплекса с помощью воды.
Рис, 10.8. Разделение смесн дегидрогеназ на N(r)-(6-аминогексил)-5'-АМР-
сефарозе с помощью градиента pH [25].
Смесь (tOO мкл). содержащую бычий сывороточный альбумин (1,5 мг) и 5 Б
каждого фермента, наносили в 10 мМ буфере (КН*РО"+КОН) (pH 6,0)
<А"3,3 мОм_<) на колонку
(50x5 мм), содержащую 0,5 г 1\1в-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозы. Колонка
промывалась 10 мМ уравновешивающим буфером (pH 6,0) перед наложением
градиента pH [pH 6-10; 10 мл уравновешивающего буфера и 10 мл 30 мМ
буфера (К*НРО*+КОН) (pH 11,0). А(tm) &6,6 mOm-j в приборе для линейного
градиента]. / - бычнй сывороточный альбумин; 2 - ма* латдегндрогеназа; 3
