Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
НМОЛЬ/МИН Доля связанной АТРазы от нанесенной, %
Без добавок 336 39 12
1 мМ. MgSO* 192 . 35 18
0.5 мМ MgSOa + 0,5 мМ АТР 678 221 33
Экстракт, содержащий аденозин-5'-трнфосфатаэу (АТРазу), наносился на
колонку с сефарозой, содержащей ингибитор АТРаэы, уравновешенную 0,2-М
сахарозой в 15 мМ трнс-ТЭС-буфере (ТЭС - К'трис'(окснмегвл)метал З-
амннозтансульфокнслота] (pH 6.6); уравновешивающий буфер содержал 3 мг/мл
тритона X-100, а также добавки, указанные в таб" лице, Количество
связанного фермента рассчитывалось по результатам элюирования; состав
элюирующего раствора: 0,2 М сахароза +45 мМ трис-ТЭС-буфер (pH 8,75)+0,S
М KCI+I мМ ЭДТА+0,3 мг/мл трятона Х-ИЮ,
264
Глава 10
ких факторов проиллюстрирована в табл. 10.2. Сорбция митохондриальной
АТРазы (диспергированной с тритоном Х-100) на сефарозе с ковалентно
связанным ингибитором зависит от присутствия ионов магния и АТР [37]. Для
достижения высокой степени очистки ацетилхолинэстеразы мозга,
солюбилизированной с помощью тритона, аффиииую хроматографию следует
проводить в присутствии тритона [9]. Занетта и Гомбос [41] проводили
аффинную хроматографию мембранных гликопротеинов на конканавалин А-
сефарозе в присутствии додецилсульфата натрия. Для удерживания
дигидроптероатсинтетазы на сульфонамид-сефарозе необходимо присутствие
дигидроптероатпирофосфата и дитиотреитола [36].
10.1.2. Практические указания для проведения сорбции
Для сорбции лучше всего образец выделяемого вещества растворять
непосредственно в буфере, из которого будет производиться сорбция, и,
если необходимо, проводить замену состава солей, присутствующих в
образце, с помощью диализа или гель-фильтрации. Если вещество, образующее
в данных условиях прочный комплекс с иммобилизованным аффинным лигандом,
выделяют колоночной хроматографией, то объем образца, вводимого в
колонку, может быть любым. Однако, если выделяют аффинной хроматографией
вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, объем
наносимого образца не должен превышать 5% удерживаемого объема, для того
чтобы предотвратить элюирование выделяемого вещества неадсорбированным
материалом. Если выделяют вещество с низким сродством к связанному
аффинному лиганду, его элюирование с колонки происходит часто даже без
замены буфера. В этом случае выделяемое вещество получают в разбавленном
растворе. Для иллюстрации сказанного можно сопоставить хроматографию
химотрипсина на сефарозе с присоединенным метиловым эфиром в-
аминокапронил-О-триптофана с хроматографией этого же вещества на сефарозе
с непосредственно связанным метиловым эфиром D-триптофана (рис. 5.4) [8].
Для элюирования химотрипсина с нерастворимого носителя, на котором
ингибитор укреплен через е-аминокапроновую кислоту в качестве
пространственной группы, необходимо изменение pH, при этом фракция
химотрипсина элюируется в виде острого пика. Если ингибитор присоединен
непосредственно к нерастворимому носителю, его пространственная
доступность понижена, и химотрипсин только замедляет свое движение через
колонку. Фермент элюируется в значительно большем объеме, при том же pH,
в непосредственной близости к неактивному материалу.
Если небольшие количества вещества выделяют из неочищенной смеси с
помощью иммобилизованного аффинного лиганда с высоким сродством, можно
очень успешно использовать сорбцию
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
265
в статических условиях (одноразовый метод), иногда в комбинации с
колоночной хроматографией на стадии элюирования. В качестве примера можно
привести выделение тироксинсвязывающих глобулинов с помощью аффинной
хроматографии на сефарозе с присоединенным тироксином. Для того, чтобы
получить более высокий выход, Пенски и Маршалл [30] проводили сорбцию в
статических условиях: нормальная человеческая сыворотка в течение ночи
перемешивалась с иммобилизованным аффинным лигандом. После промывки 0,1 М
бикарбонатом натрия нерастворимый носитель с сорбированными выделяемыми
веществами переносился в колонку, из которой затем 0,002 М едким кали
элюировались две фракции тироксинсвязывающего глобулина. Такая комбинация
статического и динамического (на колонке) методов часто встречается в
аффинной хроматографии. Тем самым увеличивается не только время контакта
выделяемых веществ с присоединенным аффинным лигандом, но и время,
необходимое для точной ориентации связывающих участков. При хроматографии
в колонках увеличение времени контакта выделяемого вещества с
иммобилизованным аффинным лигандом достигается путем остановки на
некоторое время потока через колонку после нанесения образца. Манен и
Рассел [26] установили, что если в ходе аффинной хроматографии
декарбоксилазы 5-аденозил-Ь-метионнна поток растворителя через колонку
сефарозы с присоединенным n-хлормеркурибензоатом не останавливать на 2 ч,
фермент будет элюироваться через несколько фракций и должная очистка не
будет достигнута. Достаточно низкая скорость потока через колонку со
