Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
при возбуждении, флуоресценция может быть легко отделена от
светорассеяния. Гейбл и др. [26] описали кювету, с помощью которой им
удалось методом флуоресценции исследовать конформационные изменения
иммобилизованных трипсина и химотрипсина, вызываемые мочевиной,
нагреванием или присутствием специфических лигандов. Поскольку эту кювету
не всегда можно применять, Барел и Рузенс [3] сконструировали очень
простую цилиндрическую флуоресцентную кювету, схема которой показана на
рис. 9.5.
Верхняя часть кюветы из нержавеющей стали I снабжена тефлоновой трубкой и
соединением 2; тефлоновый адаптер 3 соединен с цилиндрической
микрокюветой 4\ нижняя часть из нержавеющей стали 2 соединена с
тефлоновой трубкой и ввинчивающимся адаптером из нержавеющей стали 7. В
микрокювету (кварцевую трубку с внешним диаметром 5,0 мм и внутренним
диаметром 3,0 мм) плотно вставлен пористый тефлоновый диск 5. Держатель
кюветы изготовляется из алюминия и помещается в обычное отделение для
кюветы флуориметра. Необходимо удалить вывинчивающуюся ручку, фиксирующую
кю-ветное отделение в приборе; эту ручку заменяют другой с отверстием для
прохода тефлоновых трубок. Преимущества использования цилиндрической
кюветы (даже если светорассеяние в ней превышает рассеяние в
прямоугольной кювете) состоят в том, что цилиндрическая кювета может быть
использована в качестве хроматографической колонки, легко отмывается и
используется повторно, кроме того, количество материала при работе с
цилиндрической кюветой вдвое меньше, чем для выпускаемых промышленностью
прямоугольных кювет (50 мкл вместо 100 мкл).
254
Глава 9
Барел и Рузенс [3] использовали спектрофлуориметр Aminco Bowman SPF,
который снабжен фотоумножителем RCA R4465, эллиптической конденсорной
системой и двухкоординатным самописцем Houston 2000. Найдено, что коррек-
/ 2 J 4 5 6 7
Рис. 9.5. Схема флуоресцентной кюветы [3].
пня спектров излучения не нужна, потому что спектральный ответ
детектирующей системы (т.е. монохроматора с фотоумножителем) остается
постоянным (±10%) от 300 до 500 км. Чтобы уменьшить светорассеяние
круглой кюветой, необходимо сузить пучок возбуждающего света с помощью
щели диаметром 1 мм. Комбинируя различные щели, можно добиться ширины
возбуждающей и излучающей полос света в 10 нм. Все опыты проводили при
комнатной температуре.
Для того чтобы получить воспроизводимые спектры флуоресценции
нерастворимых белков, необходимо начинать с полностью' открытой кюветы.
Микрокювету 4 с диском 5 (рис. 9.5) с помощью пастеровской пипетки
наполняют гелем белок-агарозы (максимальный объем геля 100 мкл, но обычно
достаточно 50 мкл) н гель немедленно покрывают 100 мкл буфера, пригодного
для элюирования. Тефлоновый адаптер 3 соединяют с мнкрокюветой и ячейку
частично собирают (части 3-7). Наконец, ячейку вставляют в
кюветодержатель и помещают в спектрофлуориметр вместе с верхней частью
(У). Затем с помощью перистальтического насоса через гель пропускают
элюирующий буфер. Используют скорости потока 0,2-0,5 мл/мин. Все спектры
записывают после того, как гель промывают в течение 10-15 мин буфером.
Гели белок-сефарозы 4В облучают только в течение времени, необходимого
для записи спектров излучения, для того чтобы фотоинактивация геля была
минимальна. Образцы геля с присоединенным белком можно использовать
повторно, если работать по описанной методике, причем показано, что
фотоинактивация образцов белка незначительна. Легко можно получить
спектры флуоресценции примерно для 0,2-300 мкг белка, ковалентно
связанного с сефарозой 4В.
Не надо специально объяснять, что ту же кювету можно применять для
классической флуориметрии образцов белка в растворе. В этом случае
раствор белка вводят в верхнюю часть проточной кюветы. Это позволяет,
сохраняя в целом геометрию кюветы постоянной, сравнить спектры
флуоресценции белков в растворе и "а нерастворимой матрице. Были
исследованы растворы а-лакталь-бумина в интервале концентрацией 0,05-0,15
мг/мл в 0,05 М буфере (pH 7,5).
Описанная методика применена Барелом и Прайелсом [2] для исследования
конформационных изменений различных а-лактаминов, связанных с агарозными
носителями.
Берлинер и др. [8] изучили конформационные изменения трипсина, спин-
меченного 1 -оксил-2,2,6.6-тетраметил-4-пиперидинилме-тилфторфосфатом,
при помощи ЭПР-спектроскопии. Бенко и др. [б] исследовали влияние
связывания метгемопротеинов на частичках латекса на конформационные
изменения связанных белков с использованием скоростей продольной
магнитной релаксации протонов растворителя.
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов
255
9.6. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ, СВЯЗАННЫХ С НЕРАСТВОРИМЫМИ НОСИТЕЛЯМИ
Поскольку многие биологически активные вещества в природе находятся в
связанном с мембраной состоянии или в форме других нативных сложных
структур, хорошо охарактеризованные нерастворимые носители со связанными
биологически активными молекулами также представляют собой модели,
