Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
активными группами путем химического осаждения паров силана. Этот метод
сравним с IgG-иммобилизацией путем ти-ол-дисульфидного обмена
Топографический зонд для изуче- [48]
ния белок-белковых взаимодействий с D-галактозилтрансфера-зой
Скрининговая система для опре- [22]
деления моноклональных антител в растущих культурах
Компьютеризованная автомата- [35]
веская система для определения поверхностного антигена (HBsAg) вируса
гепатита В в биологических жидкостях
Иммуносенсоры [ 19]
* Иммуносенсоры представляют собой биосенсоры, включающие антитела в
качестве селективно связывающих компонентов. К ним относятся ферментные
иммуносенсоры, волоконно-оптические флуоресцентные иммуносенсоры,
пьезоэлектрические системы, иммуносенсоры на основе полевых транзисторов,
оптические системы, микроволновые системы, приборы на основе резонанса
поверхностных плазмонов и преобразователи, чувствительные к конформации
молекул; см. также посвященный этим устройствам обзор [33].
84
Глава 6
6.3.1. Адсорбция
Известно, что такие вещества, как оксид алюминия, активный уголь, глина,
целлюлоза, каолинит, коллодий, силикагель, стекло, гидроксиапатит и
коллаген способны адсорбировать ферменты. Этот список, очевидно, можно
пополнить ионо-обменниками, такими как DEAE-целлюлоза, СМ-целлюлоза,
DEAE-Сефадекс, Дауэкс 50 и множество фенольных смол. Большим
преимуществом адсорбции является то, что для нее обычно не требуется
никаких реагентов, и необходима лишь минимальная активационная обработка
или очистка. По сравнению с химическим связыванием (пункты 3) и 4) в
приведенной выше классификации) адсорбция меньше разрушает ферменты.'При
адсорбции ферменты удерживаются водородными и множественными солевыми
связями, ван-дер-ваальсовыми силами и, в подходящих условиях, за счет
образования комплексов с переносом электрона. !К сожалению, все эти
факторы, за исключением последнего, весьма чувствительны кизменению pH,
температуры, ионной силы и даже к присутствию субстрата данного фермента.
6.3.2. Захват
3.-
. При формировании геля в растворе, содержащем фермент, последний
захватывается в образующийся гелевый носитель. Контролируя степень сшивки
геля, этот метод можно использовать для любого фермента, поскольку в геле
белковые молекулы удерживаются трехмерной решеткой, у На рис. 6.3
показана структура полиакриламидного геля, применявшегося в ранних
разработках ферментного электрода. Кроме
Рис. 6.3. Структура сополимера ак-риламида с N.N-метилен-бис (акрил-
амидом ).
-СИг-
¦СНг-
н 1 н 1 н
1 с - сн2- 1 С - СН2 - 1 с - с 1
1 с=о 1 1 с=о 1 1 с=о 1
1 nh2 1 NH 1 1 nh2
1 сн2
1 NH 1
н с=о н
I' 1 1
-с-сн2- -с - сн2 - 1 - с -с 1
о II -и - 1 н 1 с=о 1
1 NH 1 1 NH
снг 1 СН2
NH NH
1 С=0 н 1 с=о 1
-С - сн2 - 1 1 - о-1 0 X С'Э 1 -С -( 1
1 н 1 с=о 1 н
с=о
I
NH
I
сн2
I
NH
I
с=о
NH,
Н
I
СНг-с -
I
с=0
I
NHZ
Иммобилизация биологических компонентов в биосенсорах
85
того, для иммобилизации ферментов используют также гели крахмала, найлона
и силастика.
большие диффузионные барьеры для субстратов и образующихся продуктов, что
приводит к замедлению реакции, особенно в случаях субстратов с большим
молекулярным весом, например рибонуклеазы, трипсина и декстраназы; 2)
утечка фермента из геля через крупные поры приводит к непрерывному
снижению 'ферментативной ' активности. Последняя проблема часто решается
при помощи поперечной сшивки захваченного белка глутаровым альдегидом.
6.3.3. Сшивание
^Связывание фермента с твердой подложкой можно осуществлять с помощью
бифункциональных веществ, индуцирующих образование межмолекулярных связей
(рис. 6.4)."Сшивать фермент с самим собой и дорого, и неэффективно,
поскольку при этом часть белкового материала неизбежно будет выступать
просто как подложка, и в целом ферментативная активность будет
относительно низкой. Недостатком такого подхода являются также
диффузионные ограничения и отсутствие жесткости или механической
прочности.^Бифункциональные реагенты широко применяют для стабилизации
физически адсорбированных ферментов сшиванием. В частности, глута-ровый
альдегид реагирует с лизиновыми аминогруппами фермента и, в случае
трипсина, в значительной степени предотвращает саморасщепление пептидной
связи вблизи точки закрепления на поверхности.^Для таких реакций
необходимо подбирать оптимальные условия. Так, перевод лизоцима и папаина
в нерастворимую форму быстрее всего идет при pH, близких к
изоэлектрической точке.' '
К сожалению, (этот метод имеет два принципиальных недостатка: 1) гель
создает
Глутаровый
альдегид
Бис (диазобензидин)-?., 2 -дисульфокислота
sof
N- этил -5-фенилизооксазолий- Толуол - 2 - изоцианат-З'-сульфонат $-
ивотиои,иана.т
Рис. 6.4. Некоторые бифункциональные реагенты для сшивания белков.
Гекссшетилендиизоуиаяат 1,5-Дифтор-2,4-динитро-
бензол
86
Глава 6
6.3.4. Образование ковалентных связей
' На рис. 6.5 приведены наиболее распространенные реакции образования
