Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
Гемофилия А Фактор VIII
Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
[24]
Дефицит орнитинтранскарбамилазы Орнитинтранскарбамилаза [20]
Дефицит антитромбина-3 Антитромбин-3 [2]
Болезни сердца, связанные с нарушением мета- Рецептор липопротеидов
низкой плотности
болизма холестерина [27]; 3-гидроксиметилглутамил-кофермент А-
редуктаза [4]; аполипопротеины [30]
Мышечная дистрофия Дюшене Связанный ПДРФ [1]
Хорея Хантингтона То же [9]
Муковисцидоз Связанный ПДРФ
5.3.2. Пренатальная диагностика
5.3.2.1. Источник эмбриональной ДНК., Для генетического анализа
эмбриональную ДНК можно получить либо с помощью амниоцентеза, либо
используя яйцевые ворсинки. Амниоцентез представляет собой хорошо
отработанную процедуру, которую обычно проводят на 15- 16-й неделе
беременности. Сразу после разработки в 1978 г. метода определения
гемоглобинопатий с помощью рестриктазного анализа была установлена
возможность использования для пренатальной диагностики эмбриональной ДНК
из культивируемых амниоцентов. Из колбы объединенных амниоцентов
получается большое количество эмбриональной ДНК (20-45 мкг). Правда,
чтобы клетки доросли до слияния, требуется 2-3 недели. ДНК можно получать
из клеток амниотической жидкости и без их культивирования, однако для
наработки необходимого для диагностики количества ДНК (5-10 мкг)
расходуется большой объем амниотической жидкости. Так, из 40 мл
амниотической жидкости авторы выделяли от 3 до 25 мкг ДНК, в среднем 14
мкг.
Эмбриональную ДНК можно выделять также из препарата яйцевых ворсинок,
получаемых на 9-11-й неделе беременности, что позволяет поставить диагноз
в течение первых трех месяцев. Такая диагностика имеет много существенных
преимуществ по сравнению с диагностикой во 2-й трети беременности с
использованием ДНК из амниотической жидкости. Есть, однако, риск, что на
основе процедуры отбора яйцевых ворсинок еще нельзя дать полную оценку
плода. Яйцевые ворсинки являются прекрас-
ным источником ДНК. Из пробы среднего размера получается 25-40 мкг ДНК,
то есть более чем достаточно для пренатальной диагностики. Поэтому во
многих случаях, чтобы подтвердить диагноз, ПДРФ дополнительно исследуют
еще один или два раза.
5.3.2.2. Пример из практики. Рис. 5.3. иллюстрирует постановку диагноза
Р-талассемии в первые три месяца беременности путем рекомбинационного
анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. Сначала, чтобы
установить возможность применения этого метода, проанализировали ДНК
отца, матери и их нормального ребенка. Полная диагностика оказалась
вполне осуществимой при использовании полиморфного сайта Ava II
мутантного р-глобинового гена ('РР) длиной приблизительно 15 тыс. пар
нуклеотидов (п. н.), возникающего в р-глобиновом гене при Р-талассемийной
мутации. Затем провели пренатальный анализ ДНК из препарата яйцевых
ворсинок.
Слева на рис. 5.3 приведено расположение линий в авторадиограммах,
полученных при расщеплении ДНК рестриктазой Ava II и последующей
гибридизации на блотинго-вых пленках с меченной 32Р плазмидой, включающей
ДНК гена р-глобина человека. Если сайты Ava II присутствуют (знак +) в
обеих хромосомах, обнаруживается 3 фрагмента Р-глобинового гена длиной
1,1; 2,8 и 3,5 тыс. п.н. Если такой сайт отсутствует (-) в обеих
хромосомах, то наблюдается только два фрагмента размером
3,5 и 3,9 тыс. п.н. Таким образом, полоса, соответствующая фрагменту
3,5 тыс. п.н., присутствует постоянно, а фрагмент 3,9 тыс. п. н.
возникает в результате сложения двух меньших фрагментов. В случае
гетерозиготности у данного полиморфного сайта наблюдаются все четыре
полосы, как видно на авторадиограммах ДНК отца и матери (дорожки 1 и 2
соответственно). ДНК нормального ребенка (дорожка 3) содержит только
фрагменты 1,1; 2,8 и 3,5 тыс. п. н., что свидетельствует о наличии
полиморфного сайта ( + ) в обеих нормальных хромосомах ребенка и,
следовательно, хромосомах родителей (предполагается отсутствие
рекомбинации между полиморфным сайтом и геном (3-глобина). Таким образом,
в этой семье в обеих хромосомах, несущих (3-талассемийный ген,
полиморфный сайт отсутствует, и его можно использовать как
12 3 4
П.Н,
"-3-9 -3-5 # -2-8
+ - •
-1-1
О
о
'<5 1
+ +
Рис. 5.3. Диагностика р-талассемии в первые три месяца беременности
методом рекомбинационного анализа с использованием полиморфного сайта AVA
IJ в Р-глобиновом псевдогене. На авторадиограмме (дорожки 1 и 2) видно,
что мать и отец оба являются гетерозиготными носителями р-талассемии о.
ил На дорожке 3 для нормального ребенка (О) имеется полиморфный сайт (+/
+ ), а дорожка 4 для эмбриона (А) получается -. следовательно, он
является гомозиготным носителем Р-талассемии.
Диагностика генетических заболеваний человека
75
маркер в пренатальной диагностике. Далее провели анализ ДНК из препарата
яйцевых ворсинок (дорожка 4). В этом случае авторадиограмма содержит
только полосы 3,5 и 3,9 тыс. п. н. Следовательно, у обеих хромосом
