Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
метода.-Прим. перев.
5.3. ДНК-зонды в диагностике генетических болезней
5.3.1. Обнаружение носителей генетических болезней
Наиболее изученной группой генетических нарушений являются
гемоглобинопатии. Для выявления ее носителей разработано много методик,
основанных на рестрик-тазной технике. Известные методы можно разделить на
прямые, в которых генетическая болезнь выявляется непосредственно, и
косвенные, в которых используется полиморфизм ДНК. В прямых методах
обычно требуется выделение генспецифических зондов и установление
молекулярных причин генетической болезни. Тем не менее во многих случаях
прямой подход невозможен, и приходится использовать косвенный метод.
Например, для такой генетической болезни, как мышечная дистрофия Дюшена,
для которой мутантный ген еще не идентифицирован, косвенный метод
является единственно возможным для выявления носителей этой болезни и
пренатального диагноза [10, 23].
5,3.1.1. Прямое определение. Если генетическая болезнь является
результатом деле-ции ДНК, то для прямого выявления болезни можно
использовать геномные ДНК-зонды или кДНК-зонды. При утрате значительного
участка хромосомы, комплементарного соответствующему ДНК-зонду, последний
не способен гибридизоваться на блотинговой пленке с ДНК, взятой у
больного человека. Например, а-талассемия является результатом отсутствия
в ДНК обоих а-глобиновых генов. В этом случае гомозиготность можно
диагностировать по отсутствию любого фрагмента а-глобино-вого гена,
гибридизующегося с а-генным зондом. Строго говоря, выявление гетерозигот
с такими генными делениями не является прямым, поскольку зонд будет
гибридизоваться с фрагментами ДНК нормальной хромосомы, дающими
идентичное расположение полос на пленке Саузерна. Различие состоит в том,
что интенсивность полос на авторадиограмме вдвое меньше, чем у нормальной
ДНК (если, конечно, количество нормальной и гетерозиготной ДНК
одинаковы), однако определить различия в дозах на блотинговых пленках
Саузерна технически довольно сложно. При генетических нарушениях,
локализованных в Х-хромосоме, по отсутствию гибридизации специфического
зонда можно выявлять лица мужского пола с дефектным в результате делеции
геном [20]. Но и в этом случае выявить носителей болезни женского пола
можно лишь регистрируя обуславливаемый гибридизацией сигнал, составляющий
по величине половину сигнала равного количества нормальной ДНК.
Для небольших делеций гена или в случае, когда последовательность ДНК-
зонда охватывает начало или конец делеции, генетическое нарушение можно
установить путем идентификации характерных аномальных фрагментов ДНК на
блотинговой пленке Саузерна. У носителя генетического нарушения будут
наблюдаться как нормальные, так и аномальные полосы, а у больного
человека-только аномальные. Таким способом можно выявить а-талассемию,
используя а-глобиновый генный зонд, гибридизующийся в ДНК на участке,
соседнем с началом делеции. Небольшие делеции, включающие всего несколько
сотен пар оснований, можно детектировать по наличию аномальной полосы,
которая располагается ниже полосы нормального рестрикционного фрагмента.
Этим способом можно выявлять один из типов (3°-талассемии, обнаруженный
только у индейцев (рис. 5.1.).
Генетические нарушения, связанные с утратой или вставкой в ДНК всего
нескольких нуклеотидов, нельзя выявить рассмотренным выше методом из-за
недостаточного разрешения полос на блотинг-пленках. Это же относится и к
многочисленным генетическим нарушениям, обусловленным точечными
мутациями, которые часто не приводят к заметному изменению длины
рестрикционных фрагментов. Если, однако, мутация способствует образованию
или устранению сайтов, узнаваемых рестрикта-
Диагностика генетических заболеваний человека
71
12 3 4
-7-7 6
4-4-
3 3-8 -
I •
6 2-3- • "
¦ -5-2Р
4-6 р°
Р В
н
7° 5'
деления
р в р в
II ро I i
Pst I Bgl II
Рис. 5.1. Непосредственное определение одного из типов [1°-талассемии.
обуславливаемого делецией 617 пар оснований на З'-конце /З-глобинового
гена. Дефектный /3°-ген можно определить непосредственно с помощью
рестриктаз Pst I (Р) или Bgl II (В), которые имеют распознающие сайты на
одной из двух сторон нормального и мутантного fl-генов, и поэтому
фрагменты ДНК [S-гена на 600 п. н. меньше, чем у нормального гена. На
авторадиограмме показана нормальная ДНК (дорожки 2 и 3) и ДНК
гетерозиготного носителя [1-талассемии рассматриваемого типа (дорожки 1 и
4). Видны также полосы фрагментов ДНК, содержащих кросс-гибридизирующиеся
фрагменты Ъ-глобинового гена.
зами, ее можно выявить непосредственно с помощью рестриктазного анализа
при условии, что требуемые фрагменты ДНК достаточно велики для
определения на пленках Саузерна (фрагменты, содержащие менее 50 пар
оснований, определить довольно трудно). Хорошим примером такой
генетической болезни является серповидная анемия - результат замены всего
одного основания А на Т в кодоне 6 (З-глобинового гена. Эта мутация
