Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
measurements with antigen iono-phore based membrane electrodes. Anal.
Chem, 56, 801-6 (1984).
12. Keating M. Y. Potentiometric enzyme immunoassay for digoxin using
polystyrene beads. Anal. Letts, 18 (Bl), 1-10 (1985).
13. Renneberg R.. Shlossler W" Scheller F. Amperometric enzyme sensor-
based enzyme immunoassay for factor VIII related antigen. Anal. Letts,
16, 1279-89 (1983).
14. Updike S.J., Hicks G.P. Nature (London), 214, 986 (1967).
15. Weber S. G., Purdy W. C. Homogenous voltammetric immunoassay: a
preliminary study. Anal. Letts,
12, 1-9 (1979).
16. Wehmeyer K.R., Halsall H.W., Heineman W.R. Electrochemical
investigation of hapten-antibody interactions by differential pulse
polarography. Clin. Chem, 28, 1968-72 (1982).
17. Yamamoto N., Nagasawa Y.. Sawai M" Sudo Т., Tsubomura H.
Potentiometric investigations of antigen-antibody and enzyme-enzyme
inhibitor reactions using chemically modified metal electrodes. J.
Immunol. Methods, 22, 309-17 (1978).
18. Yalow R.S., Berson S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in
man. J. Clin. Invest, 39, 1157-75 (1960).
19. Yalow R.S. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological
methods. Nature (London), 184, 1648-9 (1959).
5 1145
Глава 5
Диагностика генетических заболеваний человека
Джон М. Оулд, Кей Е. Дэвис
5Л. Введение
Генетические болезни человека являются важной проблемой международного
здравоохранения. Например, по оценкам Всемирной организации
здравоохранения в мире более 200 миллионов носителей гемоглобинопатий и
ежегодно появляется от 200 до 300 тысяч серьезно больных гомозигот или
сложных гетерозигот. В кавказских популяциях каждый двадцатый является
носителем муковисцидоза - рецессивного повреждения экзокринных желез,
приводящего к смерти пораженных этой болезнью в возрасте около 20 лет.
При некоторых генетических болезнях, для которых охарактеризованы
дефектные белки (например, Р-глобин при Р-талассемии), можно проводить
биохимические тесты на отсутствие генных продуктов в пробах эмбриональной
крови. Этот подход, однако, не является общим, поскольку генетическая
болезнь не всегда приводит к изменениям белков в эмбриональной крови. В
этих случаях особую ценность представляют специфические генные зонды,
которые можно использовать независимо от типа исследуемых клеток.
ДНК-рекомбинантная техника позволяет связывать клинический фенотип
непосредственно с изменениями в последовательности ДНК соответствующего
гена и его ближайшего окружения. Например, описаны различные изменения
последовательности оснований в ДНК, приводящие к Р-талассемии [21]. Они
действуют на различных стадиях экспрессии гена: предотвращают или
замедляют транскрипцию ДНК в предшественник мРНК, нарушают процесс
превращения предшественника мРНК в мРНК или преждевременно прерывают
трансляцию белка. При серповидной клеточной анемии ген р-глобина
производится, но с заменой функционально важной аминокислоты, что
выражается в изменении в ДНК последовательности GAG на GTG.
Для большинства генетических нарушений основной дефект неясен. Например,
все еще не известна молекулярная основа наиболее известного рецессивного
состояния-муковисцидоза. В настоящее время молекулярную биологию
применяют на практике для локализации хромосомных дефектов, что позволяет
поставить антенатальный диагноз и тем самым исключить потенциальные
переносчики болезни еще до идентификации соответствующей мутации. В
качестве маркеров хромосомальных областей, несущих наследственную
мутацию, используют ДНК-зонды; таким образом, результат не зависит от
точного знания измененной последовательности в ДНК [3].
5.2. Методики определения генетических болезней
5.2.1. ДНК-зонды
Молекула ДНК представляет собой двойную спираль, которая при обработке
щелочью может расщепляться на составляющие ее две комплементарные нити. В
соответствующих экспериментальных условиях две цепочки могут вновь
соединяться
Диагностика генетических заболеваний человека
67
(реассоциируются водородные связи между основаниями). Этот процесс лежит
в основе всех методов гибридизации ДНК. Во всех этих способах
используется небольшое количество очищенной однонитевой ДНК, которая
выполняет функцию зонда. Такой ДНК-зонд, как правило, содержит метку, и
поэтому можно непосредственно следить за его гибридизацией с
комплементарной последовательностью в избытке ДНК-мишени. Зонды обычно
метят радиоактивными нуклеотидами, так что полученные двухцепочечные
гибриды можно идентифицировать на фоне значительно большего количества
немеченной ДНК-мишени. В последнее время интенсивно развиваются методы
введения меток, не содержащих радиоактивности, например с использованием
био-тин-диТР [15], однако ни один из методов еще не достиг
чувствительности обычного метода с меткой 32Р.
Первые ДНК-зонды для экспериментов по гибридизации получали из мРНК путем
обработки ее обратной транскриптазой. Этот фермент копирует молекулы
мРНК, синтезируя одноцепочечную молекулу ДНК с комплементарной молекуле
