Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
приводит к устранению трех несколько различных рестриктазных сайтов
узнавания в нормальной последовательности (3-гена. Первым двум сайтам,
Mnl I и Dde I, соответствуют слишком короткие фрагменты ДНК, чтобы их
можно было определить без затруднений. Поэтому в данном случае более
предпочтителен разработанный ранее метод анализа связей с использованием
близлежащего полиморфного сайта Нра I (см. ниже). Однако третий
ферментный сайт Mst II, обнаруженный в мутационном локусе серповидных
клеток, генерирует легко определяемые фрагменты ДНК. На этом подходе
основан стандартный метод пренатальной диагностики, хотя точечную мутацию
серповидной анемии можно обнаружить и прямым методом с помощью
олигонуклеотидных зондов.
Олигонуклеотидные зонды представляют собой синтетические одноцепочечные
молекулы ДНК длиной приблизительно в 20 оснований. Такие зонды можно
использовать для выявления точечных мутаций. Для этого требуется пара
олигонуклеотидных зондов-один комплементарный к нормальной и другой-к
мутантной ДНК. Зонды гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК либо
на блотинговых пленках Саузерна, либо в осушенном агарозном геле, и затем
фильтр или гель промывают в таких условиях, чтобы плохо сопряженные ДНК-
гибриды дестабилизировались и удалялись с фильтра, а гибриды из
комплементарных молекул оставались на нем. Этот подход использовали для
диагностирования серповидноклеточной анемии, (3-та-лассемии и а-1-
антитрипсиндефицита [6, 13, 22].
Хотя показано, что [3-талассемия обусловлена по меньшей мере тридцатью
точечными мутациями, в каждой отдельной популяции найдено лишь небольшое
их число. В некоторых популяциях, например среди жителей Сардинии, за
подавляющее большинство случаев Р-талассемии ответственна всего одна
мутация. В такой популяции использование олигонуклеотидных зондов для
пренатальной диагностики [-талас-семии особенно удобно. Однако для
генетических нарушений с высокой частотой новых мутаций, таких как
гемофилия или мышечная дистрофия Дюшене, олигонуклеотидный метод
непригоден и приходится прибегать к косвенному методу, в котором
используется полиморфизм ДНК.
5.3.1.2. Косвенное детектирование. Разработка наиболее употребительного
метода выявления носителей генетических нарушений связана с открытием
естественных вариаций в структуре ДНК, случайным образом разбросанных по
всему геному.
В этом методе анализируется связывание полиморфизма ДНК с исследуемым
мутантным геном. Полиморфизм ДНК обусловлен тем, что из-за вариаций в
структуре ДНК утрачиваются существующие или возникают новые сайты
узнавания рестрикта-зы. В результате при обработке рестриктазой у разных
людей образуются фрагменты ДНК разной длины, в зависимости от наличия или
отсутствия данного сайта. Полиморфные фрагменты наследуются просто по
Менделю, поэтому их можно использовать в качестве маркеров как
нормальных, так и мутантных генов, при условии что полиморфный фрагмент
оказывается достаточно близко к мутантному гену, так что вероятность их
рекомбинации весьма мала [3, 11]. Пример такого полиморфизма, называемого
полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), приведен на рис.
5.2.
В 1978 г. был описан полиморфный сайт Нра I и показана возможность его
использования для диагностики серповидной анемии путем анализа связывания
рестрикционных фрагментов [11]. С тех пор в [-глобиновых генных кластерах
обнаружено еще более 17 различных полиморфных рестрикционных сайтов.
Многие из этих
Рис. 5.2. Использование ПДРФ для диагностики Р-талассемии путем анализа
связывания. Диаграмма показывает локализацию двух полиморфных сайтов Hind
II ( +) в fi-псевдоглобиновом гене (у Р) и вблизи него. С помощью v|/(3-
генного зонда можно определять четыре полиморфных фрагмента в зависимости
от комбинации присутствия или отсутствия каждого сайта (гапло-тип).
Примеры I и 2- гаплотипы двух нормальных людей.
Диагностики генетических заболеваний человека
73
полиморфных сайтов, в частности HbS, НЬЕ и НЬС, оказались весьма удобными
для выявления носителей и пренатальной диагностики Р-талассемии, хотя,
чтобы проанализировать связывание полиморфных фрагментов, требуется
изучить ДНК не только данной пары риска, но и их рожденных ранее детей
и/или родителей и близких родственников (при нарушении связывания ПДРФ,
как правило, отсутствует). Данный метод можно использовать и для
диагностики многих других генетических нарушений, даже когда их
биохимические причины неизвестны , как в случае мышечной дистрофии Дюшене
(обзор см. в [7]). В табл. 5.1 приведен перечень генетических болезней,
для которых имеются соответствующие ДНК-зонды.
Таблица 5.1. Диагностика болезней с помощью ДНК-зондов
Болезнь Генный зонд
Г емоглобинопатия а,(3,у-Глобин [17]
Коллагеновые нарушения Коллаген [25, 29]
Карликовость Гормон роста человека [16]
Эмфизема а-1-Антитрипсин [13]
Синдром Леша-Нихана Пероксидаза хрена [33]
Фенилкетонурия Фенилаланингидроксилаза [32]
Рождественская болезнь Фактор IX [5]
