Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
эмбриона полиморфный сайт отсутствует ( -). Отсюда ясно, что эмбрион
унаследовал оба р-талассемийных гена и, следовательно, болен Р-
талассемией.
5.4. Дальнейшие перспективы нерадиометрического детектирования
Момент мечения ДНК-зондов, очевидно, выбирают так, чтобы можно было
использовать 32Р-нуклеотиды с наивысшей удельной активностью. Введение
метки 32Р имеет много недостатков, в частности, ее радиоактивность может
быть опасна для здоровья. Однако еще важнее, видимо, то, что время
полураспада 32Р составляет всего 14 дней, поэтому зонды приходится метить
заново каждые 1-2 недели. Использование нерадиоактивных меток в ДНК-
зондах позволит преодолеть многие из этих недостатков и разработать
диагностические наборы для определения нуклеотидной последовательности
ДНК мутантных генов, вирусов, микроорганизмов и т.д.
Хотя в литературе описано много различных способов нерадиоактивного
мечения ДНК, к моменту написания этого обзора лишь два из них имели
некоторый успех и приобрели коммерческое значение.
Первый подход заключается в том, что вместо 32Р-нуклеотида в ДНК-зонд
внедряется химически модифицированный нуклеотид, например,
биотинированная duTP, аналог dTTP. Модифицированные нуклеотиды внедряются
стандартным способом, например ник-трансляцией, но с меньшей скоростью.
Гибридизованный ДНК-зонд с биотиновой меткой детектируют по его
взаимодействию с биотин-связы-вающими белками, такими как авидин или
стрептавидин, в комплексе с ферментами, например пероксидазой хрена,
кислой и щелочной фосфатазой, дающими окрашенные продукты, или же с
помощью системы двойных антител, используя сначала антибио-тиновые
антитела и затем флуоресцирующее вторичное тело.
Второй подход заключается в химической модификации ДНК-зонда (например,
сульфировании), не влияющей на его способность к гибридизации.
Модифицированный ДНК-зонд детектируют с помощью специфических
моноклональных антител и затем вторичных антител, конъюгированных с
пероксидазой или щелочной фосфатазой. Ряд фирм выпускают наборы для
введения метки в ДНК обоими способами. Однако чувствительность этих
систем явно недостаточна для рестрикционного анализа ДНК, целью которого
является определение менее 1 пг ДНК, соответствующей единственному гену.
Тем не менее такие системы позволяют детектировать 5-10 пг ДНК в
блотинговых пятнышках, и их вполне можно использовать в экспериментах по
генной инженерии для блотинга по Саузерну, гибридизации бляшек и колоний
при детектировании вирусной ДНК в клетках и срезах тканей клинических
препаратов, а также для in situ гибридизации ДНК-зондов с хромосомами.
Благодарность
Авторы хотели бы поблагодарить Рэчел Китт за терпеливую перепечатку
рукописи. Мы также благодарны за финансовую поддержку таким организациям,
как The Medical Research Council, The Muscular Dystrophy Group of Great
Britain, The Muscular Dystrophy Association of America.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bakker E., Hofker M.H., Goorl N., Mandel J.L, Davies K.E., Kunkel
L.M., Willard H.F.,
Fenton W.A., Sandkuyl L., Majoor-Krakauer D , Van Essen A., Jahoda М.,
Sachs E.S., Van От-
men G. J. B., Rearson P. L. Prenatal diagnosis and carrier detection
of Duchenne muscular dystrophy
with closely linked RFLPs. Lancet, 1, 655-8 (1985).
2. Bock S. C., Levitan D. J. Characterisation of an unusual DNA length
polymorphism 5' to the human
antithrombin III gene. Nucl. Acids Res., 11, 8569-82 (1983).
3. Botstein D., White R. L, Scolnick М. H" Davis R. W. Construction of a
genetic linkage map in man using restriction fragment length
polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32, 312-31 (1980).
4. Chin D. J., Luskey K, L, Faust J. R" MacDonald R. J., Broun M. S.,
Goldstein J. L. Molecular cloning of a 3-hydroxyl-methylglutamyl coenzyme
A reductase and evidence for regulation of its mRNA. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 79, 7704-8 (1982).
5. Choo K. FI., Gould K. G., Rees D. J. G" Brownlee G. G. Molecular
cloning of the gene for human anti-haemophilic factor IX. Nature, 299,
178-80 (1982).
6. Conner B.J., Reyes A. A., Morin C., Itakura Teplitz R.L., Wallace R.B.
Detection of sickle cell p5-globin allele by hybridization with synthetic
oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 278-82 (1983).
7. Davies K.E. Molecular genetics of the human X chromosome. J. Med.
Genet., 22, 243-9 (1985).
8. Feinberg A. P., Vogelstein B. A technique for radiolabelling DNA
restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal.
Biochem., 132, 6-13 (1983).
9. Gusella J. F., Wexler M. S., Conneally P. М., Naylor S. L, Anderson M.
A., Tanzi R. E., Watkins P. C., Ottina K., Wallace M.R., Sakaguchi A.Y.,
Young A.B., Shoulson I., Bonilla E., Martin J.B. A polymorphic DNA marker
genetically linked to Huntington's disease. Nature, 306, 234-9 (1983).
10. Harper P. S., O'Brien Т., Murray J.M., Davies K.E., Pearson P.L,
Williamson R. The use of linked DNA polymorphisms for genotype prediction
in families with Duchenne muscular dystrophy. J. Med. Gk, 20, 252-4
