Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
мРНК нуклеотидной последовательностью, т. е. полученная РНК может опять
соединяться с молекулой мРНК с образованием двухцепочечной гибридной
молекулы. Полученные таким способом копии ДНК-зондов (кДНК) метили, вводя
радиоактивные нуклеотиды в ходе синтеза, и затем использовали в простых
экспериментах по гибридизации ДНК в растворах. Хорошим источником почти
чистой глобиновой мРНК являются ретику-лоциты, и первыми генами,
изученными таким способом (с использованием частично очищенных а-, р- и
y-кДНК), были глобиновые гены. Благодаря этим опытам было обнаружено, что
а-талассемия обусловлена утерей участка гена, и в 1976 г. был поставлен
[12] первый молекулярно-биологический пренатальный диагноз генетической
болезни, показавший, что эмбрион, пораженный а-талассемией, можно выявить
по пониженной гибридизации а-кДНК-зонда с амниоцитарной ДНК.
Хотя в экспериментах по гибридизации ДНК в растворах было получено много
новых сведений, все же имевшиеся кДНК оказались недостаточно чистыми для
дальнейшего использования в молекулярной биологии в качестве зондов. В
1975 г. Саузерн предложил метод блотинга ДНК (мы рассмотрим его ниже),
который стал одним из важнейших методов молекулярной биологии после
разработки техники рекомбинантной ДНК, позволившей выделить чистые
глобиновые кДНК-зонды. В 1978 г. были впервые получены чистые зонды из а-
, Р- и y-кДНК человека путем введения двухцепочечных молекул кДНК в
плазмиды и выделения рекомбинантных плазмид из инфицированных
моноклональных бактерий-хозяев [31].
Разработке техники плазмидных зондов предшествовало успешное клонирование
ДНК человека в бактериофагах. Первая попытка составления библиотеки генов
человека, по которой можно быстро выделить перекрывающиеся ДНК-фрагменты
глобиновых кластеров а- и p-генов, была предпринята в работе [14]. В этих
опытах небольшие фрагменты, содержащие индивидуальные глобиновые гены,
получали из моноклональных ДНК и затем встраивали в плазмиды для
получения геномных плазмидных ДНК-зондов.
Геномные ДНК-зонды обычно представляют собой только часть гена, которая
содержит как кодирующую, так и некодирующую последовательности, тогда как
кДНК-зонды комплементарны ко всей или к большей части кодируемой
последовательности гена. Поскольку длина последовательности ДНК в
большинстве генов очень велика (в отличие от глобиновых генов), кДНК-
зонды обычно гибридизируются с длинным участком ДНК и, следовательно, с
большим числом фрагментов, чем геномные ДНК-зонды. Это может быть весьма
выгодно при поиске сайтов полиморфной рестриктазы, но не для выявления
генетических нарушений или пренатального диагноза, поскольку наличие в
авторадиограмме большого числа полос может только затруднять
интерпретацию результата. Поэтому более предпочтительны геномные
5*
68
Г. шва 5
ДНК-зонды, а в некоторых случаях и очень короткие фрагменты ДНК. Такие
фрагменты получают расщеплением геномной плазмиды рестриктазами и
выделением необходимых фрагментов ДНК с помощью гель-электрофореза и
электроэлюирования из агарозы.
Последним достижением зондовой техники является разработка коротких
синте-. тических олигонуклеотидных зондов. Эти зонды представляют собой
химически синтезированные одноцепочечные молекулы ДНК, содержащие всего
около 20 пар оснований. Последовательности основания для пары зондов
различаются всего одним нуклеотидом. Один зонд является комплементарным к
ДНК с нормальной последовательностью, а другой к той же ДНК, содержащей
точечную мутацию. Такая пара зондов будет различным образом
гибридизироваться с нормальной и мутантной геномной ДНК, и,
следовательно, наличие или отсутствие гибридизации можно использовать в
качестве диагностического признака при определении генетических
нарушений, обусловленных точечными мутациями, таких, как р-талассемия
[22].
5.2.2. Введение метки в зонды
5.2.2.1. Ник-трансляция. Это наиболее широко используемый метод введения
метки как в плазмидные зонды, так и в фрагменты ДНК. Трансляция метки
производится с помощью репарационного фермента, ДНК-полимеразы-1,
выделяемой из Escherichia coli, и ДНК-азы-1,вводящей метку в
двухцепочечную плазмидную ДНК. После введения метки ДНК-полимераза-1
удаляет стоящий перед меткой нуклеотид и добавляет новый фрагмент-
дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат к свободной З'-ОН-группе на другом
конце цепи. Радионуклеотид (обычно dCTP) вводят в охлажденную реакционную
смесь, которая содержит ферменты, буферные компоненты, плазмиду (50-100
мкг), dATP, dGTP, и dTTP. Смесь можно приготовить по методике, впервые
описанной в работе [26], или же воспользоваться коммерческими готовыми
наборами для ник-трансляции. Реакцию проводят при 16° С в течение 1 ч в
присутствии 50 мкл 32P-dCTP, 3000 Ки/ммоль (РВ 10205, фирма Amersham
International). После этого реакцию останавливают, добавляя ЭДТА, меченый
ДНК-зонд отделяют от невключе-нной dCTP либо пропусканием по 1 мл смеси
через колонку с сефадексом G-100, либо центрифугированием через сефадекс.
