Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Первая стратегия заключается в использовании стандартного вектора (ori Р-CD), содержащего ген CD, и ori Р, который способен к автономной репликации только в клетках лимфом и не обладает способностью к передаче от клетки к клетке. Вторая - вектора ori Lyt-CD, содержащего литический ori EBV, последовательности, отвечающие за упаковку вируса, а также ген BZF1 EBV, который включает экспрессию ряда белков вируса, необходимых для функционирования ori Lyt. Последняя конструкция реплицируется с on Lyt-CD домена в EBV-позитивных В-клетках лимфом, упаковывается в псев-довирион и, благодаря этому, может инфицировать другие клетки, содержащие сооте етствующий рецептор.
Было продемонстрировано, что каждая из этих стратегий генной терапии вызывает гибель EBV-позитивных В-клеток in vitro (в присутствии
223
5'-флюороцитозина). Авторами данных стратегий обсуждаются преимущества той или иной схемы для терапии различных типов лимфом (Kenny et al.,
1998).
Довольно широкое применение для моделирования генной терапии получили также векторные системы, сконструированные на основе элементов вируса SV40, которые во многих отношениях функционируют подобно векторным системам, основанным на элементах EBV. Они также включают вирусный цис-действующий элемент (ori репликации) и транс-действующий фактор - большой Т антиген вируса SV40 (T-ag SV40). Взаимодействие T-ag с ori SV40 хорошо изучено и является эталонным объектом исследования ДНК-белок взаимодействий (Boroviec et al., 1990). Исследование судьбы простой конструкции, созданной на основе этих элементов с добавлением гена селективного маркера, показало возможность обеспечения чрезвычайно высокой копийности автономного трансгена, часто превышающей уровень 1000 копий плазмидной ДНК на клетку. В cos-7 клетках такой трансген стабильно поддерживался в течении двух месяцев, причем автономная репликация трансгена происходила синхронно с репликацией хромосомной ДНК (Chittenden et al., 1991). Высокая копийность конструкций на основе ori SV40, которая недостижима для других векторов, делает их возможными прототипами для отдельных задач генной терапии.
Однако известной особенностью этих конструкций является то, что T-ag SV40 способен связываться с белками-супрессорами злокачественной трансформации и тем самым вызывать и/или модулировать ряд процессов злокачественной трансформации клетки (Jiang et al., 1993). Замечательным развитием конструкции векторов этого типа, дающим начало новому направлению в создании вирусных конструкций, является модификация гена большого T-ag, приводящая к значительному снижению его трансформирующего потенциала. Оказалось, что для этой модификации необходимо сделать несколько нуклеотидных замен в гене, приводящих к одной-двум аминокислотным заменам в его продукте (рис. 82).
Знаменательным шагом на этом пути стала разработка M.J. Cooper с сотрудниками модифицированного безопасного вектора, основанного на использовании элементов вируса SV40 (Cooper et al., 1997). Эта векторная система использует мутантный по 107 и 402 аминокислотам T-ag, который не взаимодействует с продуктами антионкогенов р53, р107, RB ( рис. 82, А и Б).
Сконструированная в этой работе векторная система включает вектор-помощник, содержащий ori и модифицированный T-ag, находящийся под контролем CMV-промотора. Вторая конструкция - репортерный вектор -включает репортерный ген и ori SV40. Котрансфекция этих плазмид приводит к поддержанию высокой копийности автономных конструкций в нескольких культурах раковых клеток человека и в лимфоидных клетках Раджи (рис. 82, В). При этом уровень репортерной экспрессии, обеспечиваемый этой системой, более чем на порядок превышает уровень, достижимый с помощью нереплицирующихся простых плазмидных конструкций (рис. 82, Г) (Cooper et al., 1997).
Другой подход к проблеме "безопасности” вирусных конструкций был развит в работе по созданию автономной конструкции, способной функционировать вообще без большого T-ag (Piechazek et al., 1999). Для этого в вектор, содержащий ori SV40, был вставлен S/MAR-элемент (scaffold matrix
224
attached region) гена Р-интерферона человека. Результаты, полученные с помощью гибридизации и спасения плазмиды, показали, что такие экстрахро-мосомные векторы высокостабильно поддерживаются в СНО клетках при низком уровне их копийности. Автономная репликация данных конструктов, по-видимому, осуществляется за счет взаимодействия эндогенного онкобелка Мус (который способен заменить T-ag в качестве транс-действующего фактора репликации) с ori, а их стабильное поддержание обеспечивается благодаря S/MAR-последовательностям, связывающим их с хозяйскими хромосомами. Можно думать, что низкокопийный и митотически стабильный вектор такого типа может быть использован в некоторых стратегиях генной терапии, направленных на долговременную и одновременно на низ-коуровненную дозировку генно-терапевтического средства.
Помимо этих двух охарактеризованных выше уникальных векторных систем существуют и иные возможности для обеспечения экстрахромосом-ного поддержания рекомбинантных ДНК за счет элементов генома некоторых других ДНК-содержащих вирусов. Из возможных вариантов (ВК-виру-сы, папиломавирусы, полиомавирусы и др.) необходимо отметить удачное использование модифицированных элементов генома вируса полиомы для создания стабильной автономной конструкции, способной к длительному существованию без интеграции в геном в культуре эмбриональных стволовых клетках мыши, а также в культурах различных клеток мыши при наличии селективного давления. Введение в эту конструкцию репортерного гена показало высокий уровень его экспрессии во всех исследованных типах клеток (Gassman et al., 1995; Camenisch et al., 1996).
