Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Очевидно, вирусные конструкции обладают уникальными свойствами в плане моделирования некоторых вариантов генной терапии. Однако классические вирусные векторы не могут быть прямо использованы для перспективных задач генной терапии (кроме, быть может, некоторых случаев терапии лимфо-пролиферативных заболеваний) ввиду потенциального трансформирующего действия собственных транс-действующих факторов, приводящего к нарушению основных требований по безопасности лечения. Безусловно перспективным направлением в данной области является разработка новых и тестирование имеющихся векторных систем, транс-действу-ющие факторы которых в значительной степени утрачивают трг сформирующую способность (онкогенный потенциал). Однако даже и в этом случае в настоящий момент трудно адекватно оценить их воздействие на живой организм.
НЕВИРУСНЫЕ ЭКСТРАХРОМОСОМНЫЕ КОНСТРУКЦИИ
В настоящий момент в свете новых требований к безопасности геннотерапевтических средств для перспективной генной терапии стала актуальной разработка невирусных автономно-реплицирующихся конструкций. Безопасность конструкций этого рода связана не только со стабильным поддержанием их автономного статуса в клетках-мишенях, но и с отсутствием побочного действия (онкопотенциала) факторов, регулирующих ori этих систем. Для конструирования перспективных векторов необходим поиск новых и использование известных компактных эукариотических ori-
8. Проблемы и перспективы...
225
элементов, регулируемых эндогенными факторами клеток-мишеней высших эукариот.
На данный момент еще не создано каких-либо генно-терапевтических конструкций с эукариотическими ori, однако ведуться интенсивные исследования ARS-активности отдельных фрагментов некоторых ori в культурах клеток млекопитающих. Целью этих работ является определение модульной структуры ori. В тех случаях, когда участок инициации репликации имеет компактный размер (2-4 т.п.н.), данные о его структуре могут быть использованы для поиска дизайна автономных конструкций.
В геноме высших млекопитающих картирована серия ori, потенциально способных к функционированию в качестве ARS-элементов (De Pamphilis,
1999). В эту серию входят несколько хорошо изученных ori двунаправленной репликации (OBR) гена дегидрофолатредуктазы (DHFR) и гена с-тус/ К первым ori относяться огф и oriy, локализованные в обширной зоне инициации репликации (более 30 т.п.н.), расположенной вблизи 3' конца гена DHFR (Dijkwel, Hamlin, 1992, 1995).
Плазмиды, сконструированные на основе фрагментов о rift, несущие селективный маркер, были способны автономно реплицироваться в культуре клеток человека при селективном давлении (Zannis-Hadjopoulos et al., 1994). Плазмида, содержащая примыкающий к оп(3 фрагмент ДНК, размером 4.8 т.п.н., также способна к автономной репликации и, по-видимому, содержит самостоятельный ori {ori\V) (Kobayashi et al., 1998). Продемонстрировано, что примыкающие к огф участки ДНК могут оказывать решающее влияние на ARS-активность содержащих их конструктов (Caddie, Calos,
1992).
В настоящий момент наиболее перспективными для генно-терапевтических целей представляются работы по изучению участка 5'-фланкирующей последовательности ДНК протоонкогена с-тус, продукт которого стимулирует репликацию, взаимодействуя с собственным ori (Ariga et al., 1989; Leffak, James, 1990). Результаты работ группы Леффака показали, что инициация репликации ДНК в области гена с-тус в клетках HeLa происходит главным образом во фрагменте ДНК размером 2,4 т.п.н., расположенном непосредственно перед промотором гена (рис. 80, A) (Malot, Leffak, 1999).
Для характеристики ARS-активности этого фрагмента гена с-тус (Hindlll-Xhol фрагмент, размером 2,4 т.п.н), была сконструирована плазмида pNeo. Мус-2.4, содержащая также селективный маркер и бактериальную последовательность плазмиды pML2 (рис. 80, Б) (McWhinney, Leffak, 1990). Перенос этой конструкции в клетки HeLa с последующим картированием новообразованной ДНК показал, что pNeo. Мус-2.4 обладает способностью к автономной репликации, инициируемой в двух сайтах HindIII-XhoI-фраг-мента этой плазмиды, содержащего ДНК с-тус (рис. 80, А, В) (Trivedi et al.,
1998).
Поддержание автономного статуса этого трансгена в клетках HeLa при селективном давлении продолжалось в течение более чем 300 генераций (примерно 1 год) с увеличением количества первоначально перенесенной в клетку плазмидной ДНК в 1000 раз. Важно отметить, что в ходе столь продолжительных периодов персистирования не было обнаружено интеграции этой конструкции в хромосому (McWhiney, Leffak, 1990). Копийность данного экстрахромосомного трансгена в клетках HeLa составляла 30-100 копий
226
на клетку. Было показано, что данный конструкт обладает значительной митотической стабильностью: за одну клеточную генерацию в отсутствие селекции терялось не более 5% плазмиды pNeo.Myc-2,4, что на порядок ниже, чем уровень потери нереплицирующихся плазмид (McWhiney, Leffak, 1990) (рис. 80В).
В настоящее время составлена структурно-функциональная карта различных генетических элементов фрагмента 2,4 т.п.н. (Trivedi et al., 1998) и проводится ее дальнейшая детализация. В составе этого фрагмента обнаружены три ACS, семь участков гиперчувствительности к ДНКазе, элемент DUE, а также минимизированный ARS, поддерживающий автономную репликацию содержащих его плазмид in vivo и in vitro. Локализация минимизированного ARS на фрагменте 2,4 т.п.н. подтверждена данными двумерного электрофореза и электронной микроскопии (Trivedi et al., там же).
