Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
F,, а также между F, и F2. Это наблюдение свидетельствовало в пользу автономного статуса трансгена. Однозначный вывод об автономном статусе трансгенов не мог быть нами сделан (на этом этапе) ввиду недостаточного для адекватной статистики количества трансгенных животных.
Для определения физического статуса трансгена в клетках мышей F2-no-коления был проведен блот-гибридизационный анализ тотальной ДНК без ее рестрикции (см выше). Как и в случае трансгенных тутовых шелкопрядов, гибридьзационные сигналы в низкомолекулярной (по сравнению с хромосомной ДНК) области были обнаружены у шести трансгенных мышей F2 поколения (рис. 85). Идентичность гибридизационных картин во всех исследованных случаях указывает на очень близкое структурное сходство трансгенов этих мышей и свидетельствует о стабилизации структуры трансгенов в Р2-поколении трансгенных животных. Множественность гибридизационных сигналов отражает существование в мышах Р2-поколения нескольких физических форм трансгена. Из этих форм одна имеет подвижность, которая совпадает с подвижностью линейной формы трансгена (3 т. п. н., см. ни-
231
же), тогда как остальные могут представлять собой либо суперспирализо-ванные формы (1,8 т. п. н.), либо относительно высокомолекулярные олигомерные формы (рис. 85).
Для более подробного изучения структуры автономных трансгенов у мышей нескольких поколений был проведен классический блот-гибридиза-ционный анализ, из которого следовало, что, начиная с момента переноса и далее при передаче по наследству вплоть до Р2-поколения, в исходной плазмиде (рг8а) происходили последовательные делеции (Николаев и др. 1998), схема которых представлена на рис. 86,А. В результате таких делеций в трансгенах мышей Р2-поколения была потеряна бактериальная и частично шелкопрядная последовательности рг8а. Важно, что картина делеций была одна и та же в потомстве основателей. При этом все исследованные трансгены Р2-животных содержали 80%-часть ARS рг8а, приблизительно совпадающую с EcoRI-PvuII фрагментом этого элемента размером 3 т. п. н и были лишены бактериальной последовательноеги вектора (рис. 86,Б) (Николаев и др. 1998).
Таким образом, при исследовании судьбы рг8а в трансгенных мышах нами были получены данные, свидетельствующие в пользу неслучайного характера перестроек автономного трансгена.
АКТИВНОСТЬ ARS ргва В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ
Одной из наиболее известных хозяйских систем по изучению автономной репликации являются дрожжи S. cerevicicte. Действительно, на этой модельной системе выполнено большинство работ по анализу процесса инициации репликации ДНК и по определению состава предрепликационного комплекса (см. обзоры: De Pamphilis, 1999; Spredling, 1999). К настоящему времени также хорошо изучена структура дрожжевых on и ARS-элементов (Koshland, 1985), которые во многом эквивалентны. Известно, что ACS-эле-менты дрожжей S. cereviciae являются обязательным компонентом ori высших эукариот (Benbow et al., 1992). Принимая во внимание эти данные, мы решили определить ARS-активность полных и делеционных вариантов ARS рг8а для определения его модульной структуры и для выявления его потенциально минимизированных вариантов.
Для того чтобы определить, способен ли ARS стабильного трансгена рг8а поддерживать в дрожжах S. cerevisiae автономную репликацию, были сконструированы плазмиды р(27-8)- и р(27-8)+, содержащие почти полную последовательность ARS рг8а, (3,95 т. п. н EcoRI-ВатШ-фрагмент), клонированную в интегративном дрожжевом векторе (pVL27) в обоих возможных ориентациях.
ARS-активность конструкций, содержащих этот фрагмент рг8а, определялась по частоте трансформации (измерялась в расчете на 1 мл трансформированных клеток и на 1 мкг вносимой ДНК). Эти данные приведены в таблице (Легчилина и др. 2001), из которых следует, что эффективность трансформации дрожжевых клеток гибридными плазмидами р(27-8) и р(27-8)+ составляет ~104 на мкг плазмидной ДНК. Эта величина соответствует уровню эффективности трансформации с использованием контрольной плазмиды репликативного типа pYAC4 и является характерной для
232
Эффективность трансформации штамма S. cerevisiae YPH857 гибридными плазмидами, содержащими фрагменты трансгена рг8а
Плазмиды Эффективность трансформации на 1мл компетентных клеток Эффективность трансформации на 1 |ig вносимой ДНК
PYac4 1,2 X 105 0,8 х 104
р(27-8)+ 1,1 X 105 0,7 х 104
р(27-8)“ 1,2 X 105 0,8 х 104
p(27-8)h-2.4 1,5 х 105 1,0 х 104
p(27-8)h-0.9 Не определена <1
p(27-8)h-0.6 Не определена <1
pVL27 Не определена <10“2
плазмид, содержащих “сильный” дрожжевой ARS. Эффективность трансформации клеток дрожжей плазмидой pVL27, интегрирующей в геном, была в 10б раз меньше, чем соответствующие величины для гибридных плазмид. При этом ориентация встроенного фрагмента рг8а в этих плазмидах не отразилась на эффективности трансформации. Таким образом, высокая частота появления трансформантов является фактом, отражающим автономную репликацию р(27-8) и р(27-8)+ и связанное с этим их экстрахромосом-ное поддержание в трансформированных дрожжевых клетках.
