Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
I
ОО
w
Q,
Си
О
н
W
<L>
И
ОО
I
ОО
W
частично перестроенные трансгены Си Си о н и стабильные трансгены
10 И 12
0,5 т.п.н. ?
Рис. 87. Электрофореграмма трансгенов, “спасенных” из дрожжевых трансформантов и гидролизованных рестриктазой PvuII (Легчилина и др., 2001)
1 - вектор р(27-8)+; 2-5 - плазмиды, “спасенные” из клеток культуры дрожжей, трансформированных вектором р(27-8)+. Во всех трансгенах присутствует “дополнительный” фрагмент ДНК, имеющий размер 0,5 т.п.н. 7 — вектор р(27—8)~; 8—12 плазмиды, “спасенные” из клеток культуры дрожжей, трансформированных вектором р(27-8)_; 6 - ДНК фага X, гидролизованная Pstl
233
Челночная структура гибридных плазмид позволила провести спасение гомологичных трансгенов, с последующим рестрикционным анализом их структуры (рис. 87). Этот анализ показал, что молекулярный вес плазмид и их структура остались без изменений в случае с вектором р(27-8). Плазмиды с противоположной ориентацией вставки - р(27-8)+ были подвержены однотипным структурным перестройкам. Действительно, из электрофореграм-мы видно, что во всех вариантах “спасенных” трансгенов, имеющих данную ориентацию экзогенной ДНК, появлялся дополнительный низкомолекулярный фрагмент (0,5 т. п. н.). Наличие однотипной перестройки структуры вносимой ДНК, так же как и в случае вышеприведенных наблюдений за судьбой дериватов рг8а в трансгенных мышах, свидетельствует о направленном характере перестройки конструкции р(27-8)+ (рис. 87) (Легчилина и др.
2001).
Таким образом, полученные данные показывают, что полноразмерный фрагмент ДНК стабильного трансгена рг8а размером 3,95 т. п. н., встроенный в дрожжевую плазмиду интегративного типа pVL27, способен функционировать в дрожжевых клетках как ARS и поддерживать тем самым автономный статус этой конструкции.
ТЕСТИРОВАНИЕ ARS-ЛКТИВНОСТИ ДЕЛЕЦИОННЫХ
ВАРИАНТОВ ргва В ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ДРОЖЖАХ
Для того чтобы выяснить, какой субфрагмент интактного фрагмента размером 3,95 т. п. н. стабильного трансгена рг8а является ответственным за ARS-активность в трансформированных дрожжах, нами были сконструированы гибридные плазмиды: p(27-8)h-2,4, p(27-8)h-0,6, p(27-8)h-0,95, содержащие PvuII-PvuII и RcoRI-PvuII субфрагменты ARS-последовательности рг8а размерами 2,4, 0,9 и 0,6 т. п. н. соответственно, которые были клонированы в дрожжевом интегративном векторе pVL27. Этими гибридными конструктами была проведена трансформация дрожжей S. cerevisiae и результаты ее эффективности представлены в таблице (Легчилина и др. 2001).
Как видно из этой таблицы, вариант трансформации с использованием плазмиды p(27-8)h-2,4 (содержащей только центральную часть ARS рг8а) на 25% более эффективен по сравнению с конструктами, несущими полноразмерный шелкопрядный фрагмент рг8а. Наоборот, трансформация дрожжевых клеток гибридными плазмидами, в состав которых входили EcoRI-PvuII фланкирующие последовательности ARS рг8а (варианты p(27-8)h-0,6 и p(27-8)h-0,9), была стабильно неэффективной - дрожжевые трансформанты не возникали, что говорит об отсутствии в изолированных фланкирующих фрагментах собственной ARS-активности. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что только центральная часть (2,4 т. п. н.) шелкопрядного фрагмента рг8а проявляет собственную ARS-активность в трансформированных дрожжевых клетках. Из этого следует, что DUE (элемент, в котором происходит локальное расплетение ДНК) должен находиться в центральном фрагменте рг8а.
Особенностью поддержания гибридных конструкций в трансформированных дрожжах являлась низкая митотическая стабильность соответствующих автономных трансгенов, составляющая величину ~1%. При этом обнаруживается, что гибридная конструкция, содержащий центральный PvuII-
234
фрагмент ARS рг8а, обладает в 6 раз большей митотической стабильностью, чем конструкты, содержащие полноразмерный ARS. Это позволяет заключить, что субфрагменты, фланкирующие центральный фрагмент, не обладающие собственной ARS-активностью, также не активны и в отношении регуляции автономной репликации и точности сегрегации трансгенов в клетках трансформированных дрожжей. В конечном итоге это означает, что ARS рг8а не является функциональным эквивалентом дрожжевых ARS-элементов, а, тю-видимому, имеет лишь минимально необходимые структурные гомологии, требующиеся для автономной репликации в клетках дрожжей.
ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ARS рг8а
В настоящий момент мы выяснили первичную структуру концевых фрагментов ARS рг8а, составляющих в сумме половину массы этого элемента. Оказалось, что генетические контексты последовательностей, фланкирующих центральный 2,4 т. п. н. фрагмент, различаются. Важной особенностью фрагмента 0,95 т. п. н. является предсказание участка изогнутой ДНК, размером 70 п. н. (рис. 88,Б). Изогнутые фрагменты ДНК не были обнаружены с помощью использованных программ в противоположном фланкирующем фрагменте.
Ранее изогнутая ДНК выявлена в составе ARS1 дрожжей (Snyder et al., 1986), в составе автономного трансгена мышей ртус(Н-Р) (рис. 88,A) (Sudo et al., 1990), а также в 2,4 т.п.н. ARS-фрагменте ori с-тус (McWhinney et al.,
