Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
221
дрожжах S. cereviciae, может быть эффективным методом структурно-функционального анализа ARS-элементов и составлять одно из направлений функциональной геномики, в том числе функциональной геномики человека. Эти раСоты могли бы служить основой, необходимой для создания перспективных автономных конструкций в интересах генной терапии.
ВИРУСНЫЕ ЭКСТРАХРОМОСОМНЫЕ КОНСТРУКЦИИ
Современные конструкции экстрахромосомных векторов основаны на использовании компактных вирусных ori (сотни пар нуклеотидов), которые нуждаются в вирусных транс-действующих факторах, активирующих эти элементы. За последние 10-15 лет сконструированы экстрахромосомные автономно реплицирующиеся векторы, использующие элементы репликации ДНК-содержащих вирусов: вируса Эпштейна-Барр (EBV), вируса обезьяны 40 (SV40), вируса бычьей полиомы (BPV), других паповавирусов.
Среди этого многообразия векторов наиболее изученными и удачно используемыми являются векторы, сконструированные на основе элементов вируса Эпштейна—Барр. Преимущество этих векторов заключается в их высокой митотической стабильности, а также в низкой частоте перестроек последовательностей вектора. Эти векторы способны к автономной репликации в клетках приматов, а также в клетках грызунов (Krysan, Calos, 1993; Tomiyasu et al.,1998).
Механизм репликации векторов, основанных на элементах вируса Эпштейна-Барр хорошо изучен. Их функциональным компонентом является ori Р - участок инициации репликации EBV, который взаимодействует с вирусным транс-действующим белком EBNA-1 (ядерным антигеном 1 вируса EBV) (рис. 81). Ori Р включает в себя два компонента: FR (family of repeats), который при связывании с EBNA-1 обеспечивает удержание вектора в ядре, и DS (dyad symmetry element), который является собственно участком инициации автономной репликации (Gahn, Schildkraut, 1989) (рис. 81). Ori Р обеспечивает синхронную репликацию экстрахромосомного вектора с хромосомной ДНК клеток-мишеней в течение ранней S-фазы клеточного цикла (Adams, 1987).
В создании векторов на основе элементов EBV можно выделить две стратегии: (а) конструирование рекомбинантных плазмид, включающих как ori Р, так и ген EBNA-Г, (б) конструирование плазмид, которые включают только ori Р или один из его двух элементов (DS или FR). В последнем случае выявление характеристик экстрахромосомного поддержания конструкций проводится в клетках конститутивно продуцирующих белок EBNA-1.
Последняя стратегия была использована для создания стабильной экст-рахромосомной мультикопийной конструкции ori PYAC, имеющей размер не менее 600 т. п. н. (Simpson et al., 1996). В этой разработке ori P-область была включена в YAC-плазмиду путем гомологичной рекомбинации в дрожжах S. cerevisiae. Полученная конструкция была перенесена в культуру клеток человека, в которых экспрессировался белок EBNA-1. Было показано, что конструкции ori PYAC была способна сохраняться экстрахромосомно в течении 180 генераций в отсутствие селекции в связанном с хромосомами со-
222
стоянии, что говорит о высокой митотической стабильности конструкций. В работе обращено снимание на то что ori P/EBNA-1 взаимодействие является достаточным условием для стабилизации трансгенов и, по-видимому, именно оно обусловливает низкий уровень их перестроек. Авторы считают, что рекомбинантные плазмиды, подобные описанным в этой работе, могут быть использованы для исследования генной экспрессии, функций генов (путем комплементации мутантных фенотипов), а также для решения задач генной терапии (Simpson et al., 1996).
Возможность стабильного поддержания рекомбинантных конструкций на основе элементов EBV, несущих репортерный ген Р-галактозидазы, была продемонстрирована для клеток грызунов (Tomiyasu et al., 1998). Был показан высокий уровень экспрессии гена Р-галактозидазы во всех клеточных линиях; при этом его экспрессия была продемонстрирована также и in vivo, при непосредственной инъекции плазмид в сердце крысы. Особенностью этой работы является использование непермессивных для EBV клеток-ми-шеней, в которых трансгены были не способны к автономной репликации. Несмотря на это, трансгены обладали большей митотической стабильностью, чем контрольные конструкции, за счет чего обеспечивался повышенный уровень репортерного продукта. Косвенно эти данные указывают на функционирование FR-элемента ori Р и в клетках грызунов.
Имеются примеры использования векторов, сконструированных на основе элементов вируса EBV, для моделирования решения некоторых геннотерапевтических подходов. Так, например, была показана вероятная эффективность таких векторов в целях локальной генной терапии EBV-ассоции-рованных неоплазм (Hirai et al., 1997). В этой работе были сконструированы экстрахромосомные векторы, содержащие ori Р и экспрессионную кассету ТК гена вируса герпеса. Эти конструкции были перенесены в культуру лим-фомных клеток, в которой далее был обнаружен высокий уровень экспрессии ТК гена. В конечном итоге было продемонстрировано ингибирующее действие продукта ТК гена на рост культуры лимфомных клеток.
Недавно были предложены две новые стратегии генной терапик лимфомных заболевании, ассоциированных с EBV, которые основаны на переносе гена-убийцы (цитозин диаминазы (CD)) в В-клеточные лимфомы с помощью векторов, основанных на элементах EBV (Kenny et al., 1998). Эти стратегии основаны на индукции процессов, приводящих в конечном итоге к апоптозу, за счет экспрессии гена CD в клетках лимфом в присутствии 5'-флюороцитозина.
