Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Таким образом, данные по тестированию ARS-активности фрагментов ori с-тус, показывают его потенциальную применимость к созданию перспективных персистирующих экспрессирующих векторов. Важным моментом для использования этого ori является прогнозируемость его функциональной активности в различных типах клеток (Тао et al., 1997), а также возможность сопряжения процессов автономной репликации и транскрипции в гибридных конструкциях, содержащих этот элемент (McWhiney, Leffak,
1990).
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА
СТАБИЛЬНОГО АВТОНОМНОГО
ТРАНСГЕНА ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА рг8а
ОБРАЗОВАНИЕ ЭКСТРАХРОМОСОМНЫХ ФОРМ ТРАНСГЕНА
ПРИ ПЕРЕНОСЕ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В РАННИЕ ЭМБРИОНЫ
ШЕЛКОПРЯДА В. MORI
На модели трансгенного тутового шелкопряда нами проводилось изучение судьбы экзогенной ДНК после ее переноса в клетки полового пути насекомых. На первоначальном этапе работы определялось влияние условий микроинъекций ДНК на выход жизнеспособных особей и влияние введенной ДНК на развитие оперированных особей. После решения технических и методических вопросов, связанных с отработкой технологии микроинъекций ДНК в ранние эмбрионы (грену) и получения трансгенных особей (Николаев, Кафиани, 1988, Николаев и др. 1989а), основное внимание было сосредоточено на характеристике процесса переноса и передачи по наследству экзогенной плазмидной ДНК.
Нами были проведены серии микроинъекций в грену различных рекомбинантных ДНК с последующим анализом их судьбы методом блот-гибри-дизации. На первом этапе осуществлялась совместная микроинъекция конструкций, что позволило быстро получить исходную информацию. С этой целью в ранние эмбрионы шелкопряда была перенесена комбинация из двух плазмид представляющая систему транспозиции, основанную на функции P-элемента дрозофилы и комбинация плазмид рр25.1 (кодирующей Р-эле-мент дрозофилы) и pPrCllLTR1.5 (несущей копии LTR вируса RSV). В обоих случаях были получены однотипные результаты.
8*
227
Основной результат, полученный в этих и других опытах, заключался в том, что плазмидная экзогенная ДНК после ее переноса в ранние эмбрионы, поддерживалась во фракции экстрахромосомной ДНК вне зависимости от ее генетической структуры.
В качестве методического подхода к определению физического статуса трансгенов нами использовался электрофорез суммарной ДНК трансгенных шелкопрядов без рестрикции. В случае комбинации плазмид рр25.1 и pPrCllLTR1.5 автономный статус гомологичных трансгенов был определен по присутствию дискретных полос гибридизации в области молекулярных весов меньших, чем у тотальной хромосомной ДНК (рис. 83, дорожки 1 и 2). Автономные трансгены представляли собой низкокопийные плазмиды (порядка 1-3 копии на геном), которые передавались по наследству (Николаев и др. 1989а, б). Исследование структуры экзогенной ДНК блот-гибридизаци-ей с рестрикцией показало, что после введения в грену экзогенная ДНК претерпевала структурные перестройки как в соматических клетках эмбриона-реципиента, так и в клетках полового пути. Об этом свидетельствовало изменение картины гибридизационных сигналов как с нерестрицированной (рис. 83, дорожки 1, 2), так и с рестрицированной тотальной ДНК бабочек F0- и Ргпоколений (рис. 83, дорожки 3-7). При этом было обнаружено, что экстрахромосомные трансгены у сибсов А и Б (дорожки 4—5, 6-7) одной и той же родительской пары отличаются и друг от друга и от родительского (дорожка 3).
Блот-гибридизационный анализ перестроек ДНК трансгенов также показал, что одни и те же гибридизационные сигналы детектируются с помощью зондов, полученных из разных переносимых конструкций. Эти наблюдения, взятые вместе, свидетельствуют о рекомбинации между экстрахро-мосомными трансгенами и указывают на высокий уровень активности рекомбинационной системы ранних эмбрионов шелкопряда. Можно предположить, что такая активность локализована в области полярной плазмы ранних эмбрионов (стадия синцициальной бластодермы) шелкопряда, в которую производились микроинъекции ДНК.
Принимая во внимание накопленный экспериментальный материал, мы заключили, что обнаружение экстрахромосомных экзогенных ДНК в бабочках F0 представляло собой закономерный исход всех экспериментов по трансгенезу на тутовом шелкопряде и происходило с вероятностью ~5%, равной вероятности получения трансгенного шелкопряда в результате единичной микроинъекции. Но и эта сравнительно небольшая вероятность получения трансгенных особей представляется значительной, если принять во внимание отсутствие во вводимых рекомбинантных конструктах ori / ARS-элементов. Наличие в бабочках F0 экстрахромосомной экзогенной ДНК, прошедшей (по минимальной оценке) 104-кратную репликацию, предполагает, что введенные молекулы ДНК приобрели подобные элементы за счет внутренних перестроек или за счет рекомбинации с молекулами фракции эндогенной экстрахромосомной ДНК шелкопряда (рис. 83 и 84). В обоих случаях экзогенные рекомбинантные ДНК должны были бы претерпеть структурные перестройки, что и показал блот-гибридизационный анализ. Одним из важных его результатов явилось обнаружение гомологичной геному шелкопряда “дополнительной” ДНК в составе автономных трансгенов уже в особях-основателях трансгенных линий (рис. 84).
