Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Weihl C.C., Ghadge G.D., Kennedy S.G. et al. Mutant presenilin-1 induces apoptosis and down-regulates Akt/PKB // J. Neurosci. 1999. Vol. 19. P. 5360-5369.
Wilmut 1., Schnieke A.E., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. 1997. Vol. 385. P. 810-813.
Ye YFortini M.E. Apoptotic activities of wild-type and Alzheimer’s disease-related mutant pre-senilins in Drosophila melanogaster // J. Cell Biol. 1999. Vol. 146. P. 1351-1364.
АВТОНОМНЫЕ ТРАНСГЕНЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ А.И. Николаев
Отдел вирусной и клеточной молекулярной генетики
Рассматривается феномен автономного (экстрахромосомного) поддержания экзогенной ДНК в эукариотической клетке, находящийся в неразрывной связи с функционированием механизма автономной репликации.
Подробно анализируются литературные и собственные данные по судьбе различных автономных гибридных плазмид после их переноса в культуру клеток и клетки полового пути высших эукариот. Большое внимание уделено вопросу взаимосвязи дизайна рекомбинантных плазмид со способностью к автономному поддержанию в клетке.
Обсуждаются возможность и варианты проектирования и использования автономных конструкций для нужд перспективной генной терапии. Сформулированы некоторые новые требования, обеспечивающие безопасность генно-терапевтических средств.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ARS - автономно реплицирующаяся последовательность.
ACS - консенсусная ARS-последовательность.
ori - ориджин репликации ДНК.
EBV - вирус Эпштейн-Барр.
SV40 - вирус обезьяны 40.
BPV - вирус бычьей полиомы.
DUE - элемент ori, где происходит локальное расплетение ДНК.
MMT - металлотионеиновый промотор мыши.
TK тимидин киназа.
спасение плазмиды - клонирование фракции кольцевой экзогенной ДНК (трансгена),
содержащей селективный маркер, с помощью трансформации клеток Е. coli суммарной ДНК, выделенной из трансгенного организма, с последующим получением бактериальных колоний, содержащих этот трансген, на селективной среде.
ЭКСТРАХРОМОСОМНОЕ ПОДДЕРЖАНИЕ ТРАНСГЕНОВ КАК ЗАКОНОМЕРНЫЙ ВАРИАНТ ТРАНСГЕНОЗА
Трансгеноз как метод переноса экзогенного генетического материала в клетки полового пути реципиента известен на протяжении более 20 лет, за которые был получен широкий круг трансгенных объектов (см. статью Андреевой и Тарантула, наст, сборник). К началу 80-х годов стало ясно, что экзогенная ДНК. перенесенная в клетки полового пути многих организмов, как правило, случайным образом встраивается в хромосомы клетки-мишени (Palmiter, Brinster, 1986) (рис. 78, А). Интегрированный в хромосому трансген наследуется по закону Менделя (Jaenisch, 1988) Считается установленным, что на уровень экспрессии интегрированного трансгена влияют такие факторы, как нуклеотидные последовательности хозяйского генома, окружающие трансген, структура хроматина в месте его интеграции, а также тандемная организация трансгена в том случае, если его интеграция произошла в виде
218
мультикопийного повтора. Влияние этих факторов обусловливает вариацию уровня экспрессии трансгена в различных трансгенных животных (Bishop,
1997).
Альтернативой традиционному подходу является получение трансгенных особей, в которых трансген присутствует в экстрахромосомной форме и, тем самым, в меньшей степени подвергается многофакторному влиянию генома хозяина (рис. 78, Б).
Последний подход первоначально представлялся умозрительным (чему способствовал большой поток материала по интегрированным трансгенам), до тех пор пока в середине 80-х годов не был продемонстрирован феномен экстрахромосомного поддержания трансгена в трансгенных мышах (Kies-sling et al., 1986). Появление этих и других данных позволило предположить, что для экстрахромосомного поддержания трансгена достаточным условием является наличие в нем автономно-реплицирующейся последовательности (ARS) подобной той, которая в те же годы была обнаружена в эндогенных плазмидах дрожжей S. cereviciae (Umec et al., 1989). Для подтверждения этой гипотезы в качестве средства автономной репликации трансгена был использован механизм репликации ДНК-содержащих вирусов, достаточно хорошо изученный к тому времени. С этой целью в одном из модельных опытов в пронуклеус мышей была введена плазмида, несущая фрагмент генома вируса полиомы, содержащий участок инициации репликации (ori) вируса, а также последовательности трех Т-антигенов этого вируса, кодирующие факторы необходимые для инициации репликации (Rassoulzadegan et al., 1986). Было обнаружено, что трансгены в полученных животных F0- и Fr поколений, как и ожидалось, локализованы экстрахромосомно и наследовались, как это также ожидалось, с нарушением законов Менделя. Оказалось, что экстрахромосомные трансгены большинства трансгенных животных отличаются от исходной плазмиды тем, что вирусные последовательности подверглись перестройкам и в ряде случаев вообще не выявлялись в составе трансгенов. Вместо них в составе трансгенов появились последовательности центромерной ДНК мыши, которые, как предположили авторы, вносили определяющий вклад в поддержание экстрахромосомного статуса трансгенов в трансгенных мышах (Rassoulzadegan et al., 1986).
