Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
228
Без Рестриктаза
рестрикции PstI
1 2 3
Экстрахромосомные
трансгены
— 20 т.п.н.
8 т.п.н.
4 т.п.н.
— 1.2 т.п.н.
Рис. 83. Обнаружение нестабильных экстрахромосомных трансгенов тутового шелкопряда, образовавшихся после переноса рекомбинантной экзогенной ДНК в ранние эмбрионы с помощью блот-гибридизационного анализа (Николаев и др., 1989)
Дорожки: 1 - суммарная ДНК основателя семейств сибсов А и Б; 2 - суммарная ДНК одного из сибсов А; 3 — суммарная ДНК основателя, гидролизованная PstV, 4—5 — суммарная ДНК сибсов семейства А, гидролизованная Pst\\ 6-7 - суммарная ДНК сибсов семейства Б, гидролизованная Pad
Можно предполагать, что тутовый шелкопряд В. mori обладает уникальной рекомбинационной системой, которая в ряде случаев может быть использована для модификации переносимой ДНК с целью придания ей способности к экстрахромосомному поддержанию в клетках этого организма.
СТАБИЛИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ ТРАНСГЕНОВ В Р2-ПОКОЛЕНИИ ТРАНСГЕННОГО ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА
Для дальнейшей характеристики поддержания экстрахромосомных трансгенов у тутового шелкопряда было предпринято систематическое изучение судьбы рекомбинантной плазмиды pPrCllLTR1.5 после ее переноса в ранние зародыши этого насекомого. В ходе этого исследования, как и в предыдущих случаях, было установлено, что гомологичные введенной плазмиде последовательности передавались потомству в экстрахромосомной форме со структурными перестройками. Анализ серии блот-гибридизаций поз-
229
волил составить схему перестроек pPrCllLTR1.5, имевших место от момента переноса этой конструкции в ранние эмбрионы шелкопряда и далее до поколения F2 трансгенных насекомых. Эта схема приведена на рис. 84. (Николаев и др., 1991, 1993а; Nikolaev et al., 19936). Из Р2-поколения трансгенных насекомых методом спасения плазмиды нами был клонирован автономный трансген рг8а (Чкония и др., 1991). Эта плазмида (рг8а) образовалась в клетках тутового шелкопряда в результате негомологичной рекомбинации in vivo между переносимой плазмидой pPrCllLTR1.5 (Gazaryan et al., 1987) и ДНК хозяина в Р0-Р2-поколениях трансгенных насекомых (рис. 84, А). Было показано, что “спасенная” плазмида рг8а содержит бактериальную последовательность pBR322 (BamHI-EcoRI фрагмент размером 3.6 т.п.н.) и фрагмент последовательности ДНК шелкопряда размером 4 т.п.н., соединенный с бактериальной последовательностью (рис. 84, Б). Эта последовательность содержит ARS шелкопряда, обеспечивающий экстрахромосомное (автономное) поддержание трансгена в клетках тутового шелкопряда. Важно, что все небактериальные последовательности pPrCllLTR1.5, в том числе и LTR, отсутствуют в рг8а (Чкония и др., 1991; Николаев и др. 1992).
Для проверки стабильности структуры рг8а были получены трансгенные насекомые ^-поколения, а также был осуществлен перенос собственно рг8а в ранние эмбрионы тутового шелкопряда.
Блот-гибридизационный анализ показал, что трансгены особей F3-n0K0-ления и вновь полученных основателей неотличимы от рг8а (Николаев и др., 1993а). Кроме того, нами было проведено “спасение плазмиды” из препаратов тотальной ДНК бабочек F3 и F0 поколений (вновь полученные основатели). Детальный рестрикционный анализ “спасенных” плазмидных ДНК также показал, что трансгены во всех исследованных случаях имеют автономный статус и идентичны рг8а (Николаев и др. 1992, 1993а).
Таким образом, в отличие от передачи трансгенов по наследству в F0-F2 поколениях (в процессе которых имели место перестройки структуры трансгенов), в F2 и дальнейших поколениях трансгенных насекомых произошла стабилизация структуры автономного трансгена в форме плазмиды рг8а. Самостоятельный перенос этой плазмиды в ранние эмбрионы тутового шелкопряда был более не связан с изменениями структуры трансгена, что позволяет сделать заключение о том, что рг8а является стабильным автономным трансгеном тутового шелкопряда, содержащим ARS-элемент шелкопряда.
АВТОНОМНЫЙ СТАТУС И НЕСЛУЧАЙНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ рг8а И ЕЕ ДЕРИВАТОВ В ТРАНСГЕННЫХ МЫШАХ
Для выяснения степени универсальности функции ARS рг8а был осуществлен перенос этой плазмиды в зиготу мыши. Микроинъекции плазмидной ДНК были сделаны либо в цитоплазму зиготы, либо в мужской пронуклеус. Трансгенные мыши были получены только во втором варианте микроинъекций, что свидетельствует о локализации процесса автономной репликации рг8а в ядре клеток раннего эмбриона мыши.
Изучение схемы наследования трансгена показало, что имела место не-менделевская, близкая к 100% передача трансгена между поколениями F0 и
230
олигомерные
трансгены
Трансгенные мыши ^поколения 1 2 3 4 5 6
Ь*т - •
23 т.п.н.
мономерные
трансгены
Я ? .II н
_ 1.8 т.п.н.
СТАБИЛИЗАЦИЯ
ГРАНСГЕНОВ
Рис. 85. Обнаружение и характеристика экстрахромосомных трапа енов мышей Р2-поколе-ния, потомков основателя № 1, полученного после переноса в пронуклеус мыши плазмиды рг8а с помощью блот-гибридизационного анализа (Nikolaev et al., 2003)
№ 1-6 - трансгенные мыши Fi-поколения, содержащие экстрахромосомные трансгены, имеющие размер 3 т.п.н. (см. также рис. 86, Б) 3 т.п.н. - положение линеаризованного трансгена
