Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
1995). Предполагается, что участок изогнутой ДНК является одним из обязательных модулей ^///ARS-элементов (Benbow et al., 1992).
Фрагмент 0,95 т. п. н. имеет участки сходства с несколькими последовательностями генома человека: 5'-фланктрующей последовательностью псевдогена си-интерферона, повторами MER27 и LINE1 (рис. 89). На противоположном фрагмент е (0,6 т. п. н.) нам не удалось выявить какие-либо протяженные повторяющиеся элементы. Фрагмент 0,95 т. п. н. имеет две области гомологии с ACS-элементом дрожжей (9 совпадений из 11), а также девять октамерных мотивов, из которых один является сайтом связывания фактора транскрипции Octl (Николаев и др., 1998). Области гомологии с консенсусной ARS-последовательностью, а также сайт фактора Octl отсутствуют в противоположном фланкирующем фрагменте, хотя и в этом фрагменте имеются три октамерных мотива. Известно, что ACS яьляются неотъемлемым компонентом эукариотических участков инициации репликации (Palzkill, Newlon, 1988; McArthur et al., 1991; Benbow et al., 1992). Участие в регуляции репликации транскрипционного фактора Octl является установленным фактом и продемонстрировано в случаях многих вирусов и позвоночных (Neil et al., 1988; Melvin, De Pamphilis, 1993; Луняк, Тимченко, 1994). Известно также, что октамерные мотивы являют; я компонентами промотор-но-энхансерных элементов генома высших эукариот и могут принимать участие в регуляции репликации (Iguchi-Ariga et al., 1993). Исходя из этих наблюдений, мы предполагаем, что 0,95 т. п. н. фрагмент действительно может иметь значение для регуляции инициации репликации в области полноразмерного ARS рг8а.
235
На этом фрагменте и только на нем локализованы участки сходства с минимальными ori 5’-области гена с-тус человека и вируса BPV1, а также с фрагментом ДНК DARK 146, обнаруживаемом в пререпликационном комплексе, включающем ДНК-полимеразу а (Николаев и др. 1998). Интересным наблюдением является обнаружение 70%-ного сходства двух участков этого фрагмента с энхансером репликации REE1 (Obuse et al., 1996).
Очевидно, что ни одно из перечисленных черт сходства, рассматриваемое отдельно, не является значимым для какой-либо функции этого фрагмента. Однако совместная компактная локализация участка предположительно изогнутой ДНК, участков указанных гомологий и сходства говорит в пользу специфичной первичной структуры фрагмента 0,9 т. п. н., которая может быть важной для функционирования этого фрагмента в качестве одного из модулей ARS рг8а.
Отмеченные генетические и физические отличия фланкирующих ARS рг8а фрагментов могут быть важны для понимания особенностей поддержания трансгенов в мышах. Действительно, в последнем случае для автономной репликации трансгенов в F2 поколении трансгенных мышей (где имеет место стабилизация их структуры) требуется EcoRI-PvuII-фрагмент рг8а размером
3 т. п. н включающий фрагмент 0,95 т. п. н, тогда как фрагмент 0,6 т. п. н., находящийся с противоположной стороны ARS рг8а, подвергается элиминации при передаче по наследству мышам Егпоколения (Николаев и др. 1998).
ЗАКОНОМЕРНОСТИ В СУДЬБЕ НАСЛЕДУЕМЫХ АВТОНОМНЫХ ТРАНСГЕНОВ
Автономные трансгены, созданные и охарактеризованные к настоящему времени, были неоднократно использованы для изучения инициации автономной репликации в эукариотической клетке (Nielsen et al., 2000; Trivedy et al., 1998; Waltz et al., 1996; Piirsoo et al., 1996). Автономные конструкты являются полезными инструментами также для исследования мутационных процессов (Zemik-Kobak et al., 1995; Inga et al., 1995) и определения взаимосвязи между интегрированными и экстрахромосомными формами вирусных геномов в эукариотической клетке (Mazur et al., 1995; Ten Hagen et al., 1995; и др.). Большинство работ данных направлений базировалось на механизмах вирусной автономной репликации, тогда как изучение on/ARS-элементов высших эукариот было реализовано только для случая ori с-тус. Очевидно, что изоляция новых ARS высших эукариот и изучение структуры и функции этих элементов (в том числе в сравнительном аспекте) может способствовать прогрессу в понимании как общих закономерностей репликации ДНК, так и принципов конструирования стабильных автономных векторов для различных специализированных исследований.
Стабильный автономный трансген рг8а был клонирован в ходе изучения трансгеноза у тутового шелкопряда В. rnori. Данный трансген возник в результате негомологичной рекомбинации переносимой ДНК с клеточной ДНК (тю-видимому, с ее экстрахромосомной фракцией) шелкопряда (Николаев и др., 1991; Чкония и др., 1991). Эта рекомбинация привела к транспозиции фрагмента ДНК шелкопряда в трансген, сопровождаемой перестройками его структуры (Nikolaev et al., 1993). Именно эти события дали транс-
236
гену ARS, обеспечивающий его автономный статус в клетках тутового шелкопряда (рис. 83). Ранее похожий ход событий, описывающий судьбу переносимого рекомбинантного конструкта, был показан на модели трансгенной мыши (Rassoulzadegan et al., 1986; Leopold et al., 1987). В работах этой группы авторов был также подробно охарактеризован процесс перестройки трансгена при его наследовании, показавший транспозицию хромосомных последовательностей ДНК мыши в состав автономных трансгенов, сопрово-ждаюшуюся как элиминацией оригинальных фрагментов вектора, так и ин-серцией фрагментов клеточной ДНК в состав трансгенов. В ходе этого процесса не были обнаружены стабильные формы автономных трансгенов мыши. Напротив, в нашем случае плазмида рг8а является стабильным автономным трансгеном шелкопряда, поскольку ее собственный перенос в эмбрионы тутового шелкопряда уже более не приводил к каким-либо изменениям структуры трансгена (Николаев и др., 1993). Таким образом, в нашем случае серия перестроек экзогенной ДНК привела к образованию стабильного, “адаптированного” к данной хозяйской системе (тутовый шелкопряд) трансгена (Николаев и др., 1993).
