Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
риалом, что не позволяет прямо следить за функционированием митохондрий.
Чтобы преодолеть последнее затруднение, мы решили на время вернуться к световому микроскопу. Этим методом, в принципе, можно увидеть митохондрии в живой клетке, но тонкие митохондриальные филаменты и сети часто ускользают от наблюдения из-за низкого разрешения микроскопии в проходящем свете. Такого рода ограничение снимается, если работать не с поглощением, а с эмиссией света. Когда эмиссия достаточно интенсивна, источник света можно увидеть в темноте, даже если его не удается наблюдать как тело, задерживающее свет.
Итак, проблема состояла в том, как заставить митохондрии светиться. Для достижения этой цели мы применили тот же подход, что ранее помог нам обнаружить генерацию AY на митохондриальной мембране, а именно проникающие синтетические катионы. Единственная разница была в том, что теперь предстояло найти катионы, способные флюоресцировать. Ведь если флюоресцирующий катион распределится между цитозолем клетки и митохондриями в соответствии с AY, то в митохондриальном матриксе его концентрация может быть до 104 раз большей, чем в цитозоле. И тогда свечение ранее невидимых нитчатых митохондрий Можно будет наблюдать под флюоресцентным микроскопом.
350 6. Регуляция, транспорт и стабилизация протонного потенциала
В поисках флюоресцирующих проникающих катионов мы обратили свое внимание на родамины. Эти соединения, во-первых, положительно заряжены, во-вторых, довольно гидрофобны и, в-третьих, флюоресцируют с высоким квантовым выходом. Кроме того, из работ Йоханнеса [777], выполненных еще в 1941 г. посредством светового микроскопа, было известно, что определенные производные родамина специфически окрашивают митохондрии в живой клетке.
Опыты, проведенные в нашей группе И. И. Севериной [95, 1359], показали, что этилродамин, добавленный в растворы, омывающие плоскую фосфолипидную мембрану, создает диффузионный потенциал, величина которого соответствует расчетной по уравнению Нернста. Это означало, что этилродамин обладает свойствами проникающего катиона. В других опытах, поставленных в нашей группе Д. Б. Зоровым, этилродамин был использован для выявления митохондриального ретикулума в мышце диафрагмы. К сожалению, этот объект оказался далеко не лучшим для налаживания нового метода из-за большого светорассеяния и малого диаметра митохондриальных тяжей, образующих сеть.
Более счастливыми оказались Чен и сотр., занявшиеся этой проблемой чисто случайно. Они обнаружили, что обработка клеток фибробластов в культуре продажным препаратом антител, конъюгированных с родамином В, выявляет внутри клетки какпе-то «змеевидные структуры», которые впоследствии удалось идентифицировать как митохондрии [1572]. Как выяснилось в дальнейшем, окрашивание вызывал не сам конъюгат, а содержавшаяся в нем примесь свободного родамина В [374]. Систематическое исследование обнаруженного феномена показало, что родамины ЗВ, 6G и 123, а также другие флюоресцирующие гидрофобные катионы, так же как сафранин О и цианиновые красители, добавленные к живым клеткам, избирательно накапливаются митохондриями, придавая им способность флюоресцировать. Разобщители или валиномицин плюс К+ гасят свечение митохондрий. Таким образом отвечали не только фибробласты, но и клетки первичной культуры миокардиоцитов и эпителия мочевого пузыря. Особенно удобным оказался родамин 123 (метилродамин) из-за своей низкой токсичности для клетки [779—781]. Впоследствии родамин 123 был широко использован для прижизненного выявления митохондрий в животных и растительных клетках (см. обзоры: [244, 1472], а также [149, 192, 395, 429, 767, 1091, 1490, 1491]). В группе Бернса [1384] удалось наблюдать колебания Д? в минутной шкале, измеряя флюоресценцию родамина в отдельной митохондрии посредством микрофлюориметра.
Как было найдено в нашей группе И. И. Севериной и Г. В. Мурванидзе, этилродамин может быть использован для измерения Д? на бактериальной мембране [95, 1359] (см. также: [1491]). Используя быстродействующую микрофлюориметрпю, уда-
6.2. Транспорт энергии вдоль мембран в форме ДцН
351
лось зарегистрировать миллисекундную кинетику изменения AY в отдельной клетке цианобактерии [1358].
Главный результат флюоресцентных исследований митохондрий в живой клетке состоит в том, что in vivo эти органеллы достаточно часто представляют собой филаменты длиной в десятки микрометров. Иногда митохондриальные филаменты имеют такую большую протяженность, что могут связывать периферию и центр клетки или даже пересекать клетку от края до края. В ряде типов клеток был выявлен митохондриальный ретикулум. Часто в клетке сосуществуют две популяции митохондрий — длинные нитчатые и мелкие овальные. Такая картина была обнаружена, в частности, Д. Б. Зоровым при исследовании первичной культуры фибропластов человека (рис. 108).
Следует отметить, что преимущественная ориентация нитчатых митохондрий вдоль длинной оси клетки (см. рис. 108) исчезает под действием ядов, разрушающих микротрубочки. При этом длина нитей не изменяется. (О специфических связях митохондрий с микротрубочками см.: [679, 1430].) В то же время некоторые лекарственные и другие воздействия in vivo могут вызывать фрагментацию длинных митохондрий на мелкие овальные (см., например, [1561]).
