Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
Звездообразные конъюгаты с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля были синтезированы на основе гетерологичных ферментов аспарагиназы из Е. coli [106], дрожжевой уриказы [107] и др. Цианурхлоридным методом к одной аминогруппе аспарагиназы удавалось присоединить два полиэтиленгликоле-вых «луча» (по С(4) и С(б) триазинового цикла, связь с белком по С(2) [108]. Полученные конъюгаты не обладали ни иммунореактивностью, ни иммуногенностью, но их ферментативная активность оказалась невысока. Повысить активность удалось за счет модификации меньшего числа аминогрупп в белке. Для конъюгата монометилового эфира полиэтиленгликоля с М = = 5 тыс. с уриказой при модификации 36 из 98 аминогрупп фермента удалось полностью устранить связывающую способность по отношению к соответствующей антисыворотке и сохранить 45% ферментативной активности [109]). При этом конъюгат более длительно циркулировал в кровяном русле.
Антиген. Е (аллерген пыльцы крестовика) был модифицирован этим методом различными эфирами полиэтиленгликолей [ПО]. Уменьшение антигенности белка зависит от М полимеров и природы группы, определяющей гидрофобность конъюгата в целом. Снижение антигенной активности отражает как уменьшение числа антигенных детерминант в результате модификации, так и снижение их сродства к специфическим антителам. Молекулярная масса «лучей», по-видимому, должна составлять несколько тысяч, дальнейшее ее увеличение не усиливает экранирование детерминант. При том же числе и длине «лучей» звездообразный конъюгат с аллергеном Е, полученный триази-новым методом, показал только 1 % антигенной активности исходного белка [111]. Возможно, что это результат сшивки белка бифункциональным триазиновым производным монометилового эфира полиэтиленгликоля. Помимо снижения антигенной активности звездообразный конъюгат аллергена Е обнаружил большую устойчивость к протеолизу. То же относится и к аналогич-
но
ному конъюгату каталазы. Защиты белка от термоинактивации звездообразные конъюгаты не дают [106]. Увеличение сроков циркуляции в кровяном русле свойственно почти всем звездообразным конъюгатам. Так, время полувыведения конъюгата глутаминазы-аспарагиназы (71 % аминогрупп модифицированы полиэтиленгликолем 5000) из кровяного русла мышей составляет 24 ч по сравнению с 2 ч для нативного фермента [112]. Повышение М модифицирующего полиэтиленгликоля с 1,9 до
5,0 тыс. мало сказывается на времени циркуляции конъюгатов.
Хорошо известно свойство белков связываться с полиэлек-тролитными носителями множественными солевыми связями. Особый интерес представляют комплексы, растворимые только при определенных значениях pH [113]. Однако обычно область осаждения таких комплексов растянута, в то время как для медицинского применения желательно иметь по возможности узкий интервал осаждения, расположенный в области физиологических значений pH. Пути к получению таких полимер-белковых соединений связаны с нестехиометрическими полиэлектро-литными комплексами, содержащими белок в дефектах структуры [114]. Так, ферменты пенициллинамидаза и алкогольде-гидрогеназа ковалентно связаны с одним из компонентов комплекса— поликатионом, а полианион защищает молекулы ферментов, разместившиеся в дефектах комплекса. В качестве полианиона была использована полиметакриловая кислота с Мш= =260 тыс., в качестве поликатиона — сополимер 4-винил- 1-этил-пиридиния с 5—10% 4-винил-1-(2-гидроксиэтил) пиридином Mw = 40 тыс., к которому триазиновым методом был присоединен фермент. В зависимости от pH и ионной силы раствора комплекс, содержащий фермент, может существовать в трех состояниях — А, Б и В. Первое из них А — нестехиометрический комплекс с ядром стехиометрического состава и общим
соотношением зарядов 3:1 (избыток карбоксильных групп)—¦ растворим, а два других Б (состав тот же, но ядро отсутствует) и В (стехиометрический комплекс 1 : 1, ядра нет, часть полианиона высвободилась в раствор)—нерастворимы [114, 115].
Комплекс А образуется при прямом смешении компонентов (результирующий Mw— 1,2 млн.); при изменении pH в определенных пределах (в данном случае от 5,90 до 5,70, т. е. всего на 0,2 единицы) происходит разделение фаз и осаждение комплекса Б. Процесс обратим и не сопровождается потерей ферментативной активности. Аналогично осаждается комплекс В при небольшом изменении ионной силы раствора (на 0,01^-0,02 М), при этом в раствор выделяется часть полианиона. Описанный принцип потенциально пригоден для получения ферментных конъюгатов медицинского назначения, когда требуется целевой транспорт фермента в области с незначительно измененными pH или ионной силой.
5.4. МЕЖМОЛЕКУЛЯРНО СШИТЫЕ БЕЛКИ
Как уже было отмечено, полимерами-носителями в водорастворимых белковых конъюгатах могут быть не только синтетические полимеры или биополимеры небелкового характера, но и сами белки. В тех случаях, когда в качестве носителя используют тот же белок, который оказывает физиологическое действие, обычно говорят о гомоконъюгатах, если же друг с другом соединяют разные белки, то образуются гетероконъюгаты. Здесь будут рассмотрены водорастворимые сшитые белки и их биологическая активность.
