Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
Большой интерес представляет использование в качестве носителей ферментов физиологически активных полимеров, усиливающих действие иммобилизуемого фермента. Так, природный антикоагулянт — гепарин — связывали карбодиимидным методом с модельным протеолитическим ферментом — химотрипси-ном [79], так как тромболитическую терапию обычно проводят на фоне гепаринизации. Конъюгат содержал 100 мг фермента на 1 г носителя и сохранял 90 % активности исходного фермента. Константа ингибироваьия высокомолекулярным ингибитором не изменяется, но для полного ингибирования требуется более высокая концентрация. Термостабильность конъюгата при 37 СС достаточно высока для потенциального биомедицинского применения (сохранение 80 % активности через сутки).
Конъюгаты урокиназы с гепарином обладают одновременно тромболитической и антикоагулирующей активностью [80].
Ряд протеолитических, фибринолитических и муколитиче-ских ферментов (трипсин, ct-химотрипсин, фибринолизин, колла-геназа, гналуронндаза и др.) были связаны карбодиимидным методом с производными N-оксидоб полиэтиленпиперидина и полиэтиленпиперазина, которые обладают собственной физиологической активностью (см. гл. 1) [81]. Во всех случаях была достигнута значительная термостабилизация ферментов, а их активность в ряде случаев оказывалась в 2—7 раз выше, чем для нативного фермента. Такие конъюгаты предложено использовать как противофиброзные комбинированные средства.
Интересны работы по получению полимерных производных высокомолекулярного панкреатического ингибитора трипсина [82]. Ингибитор, связанный с декстраном через 2-амино-4,6-дихлор-1,3,5-триазин в гетерогенной среде, показал низкую активность в конъюгате (9 % от исходной), что объяснялось участием в связывании Ые-аминогруппы остатка лизина, входящего в активный центр ингибитора. После временной защиты аминогрупп цитраконовым ангидридом тем же методом удалось получить конъюгат с полным сохранением активности, так как связывание полимера происходило по видимому, через тирозиновые остатки. Конъюгат был термостабильнее исходного белка, хотя полимер сам по себе влияния на стабильность не оказывал. Применение карбоксиметилцеллюлозы и ДЭАЭ-декстрана в качестве полимеров-носителей выявило сильные зарядовые эффекты. Замена аминодихлортриазина как конденсирующего агента на трехфункциональный цианурхлорид снижало активность присоединенного белка из-за сшивания полимерного носителя. Связывание с отрицательно заряженными носителями (карбоксиметилцеллюлозой) позволяет получить высоко активный и более термостабильный конъюгат, который взаимодействует с трипсином с той же скоростью, что и исходный ингибитор. Применение в качестве полимера носителя карбоксиметил-декстрана (у = 60, я = 300) позволило предварительно связать ингибитор протеиназ Кунитца (р/=10,5) в полиэлектролитиый комплекс так, что на одну молекулу носителя приходилось более одной молекулы ингибитора [83]. Ингибирующая активность конъюгата зависела от состава: при 2 молекулах ингибитора в поликомплексе она полностью сохранялась а при 18 — уменьшалась вдвое. Помимо ингибитора в состав конъюгат* входили остатки p-D-raлактозы, которые обеспечивали рецеп-тор-медиируемый эндоцитоз всей макромолекулы гепатоцитами, т. е. целевой транспорт в печень. Такой конъюгат содержал
4 моля ингибитора и 12 молей лактозы на моль носителя. Выведение с мочой лактозаминированного конъюгата замедлялось в 2,3 раза по сравнению с лактозаминированным ингибитором. После внутривенного введения животным упомянутого выше
полиэлектролитного комплекса ингибитора в крови в течение
5 ч поддерживался постоянный уровень антипротеолитической активности. Лактозаминирование изменяет распределение ингибитора между почками и печенью в пользу последней, причем скорость накопления в печени и его эффективность зависят от числа остатков лактозы и М конъюгата.
Особый интерес для медицины представляют полимерные конъюгаты инсулина, которые могли бы длительно циркулировать в кровяном русле и обладали бы гипогликемической активностью. Для присоединения инсулина к декстрану с Mw « «2 млн. использован бромциановый метод [84]. Так как связывание белка проводили при pH = 9,4, с активированным полисахаридом преимущественно реагировала аминогруппа остатка Lys29 в В-цепи, несущественная для проявления активности. Конъюгат показал физиологическую активность как in vitro, так и in vivo, причем ее уровень был лишь немногим ниже, чем у свободного инсулина. В отличие от последнего конъюгат не проникал через поверхность мышечных клеток. Последующие исследования, однако, не подтвердили данных об относительно высокой физиологической активности высокомолекулярных конъюгатов инсулина.
В качестве полимеров-носителей в конъюгатах инсулина применялись также синтетические полимеры. Ацилированием белка сополимером винилпирролидона с кротоновой кислотой была получена смесь моно-, ди- и триацилированных продуктов (по числу прореагировавших аминогрупп белка) [85]. Моно-и диацилированный конъюгаты обладали 62—71 % физиологической активности исходного инсулина при полном сохранении иммунологической специфичности, в то время как триацилиро-ванный конъюгат сохранил только 38—46 % активности, а иммунологическая специфичность у него была потеряна. Маскировка иммунологической специфичности для инсулина особенно важна, так как в медицине часто используют гетерологичный белок (например, свиной для человека). Работы по звездообразным полимерным производным инсулина (см. ниже), по-видимому, указывают на перспективность получения растворимого конъюгата инсулина, так как позволяют в достаточной мере сохранить активность и снизить антигенность. Могут представлять интерес и нерастворимые полимерные производные инсулина, постепенно деградирующие в организме с выделением активного гормона в виде растворимого конъюгата [86].
