Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
личались от свойств исходного фермента. При инициировании полимеризации винилпирролидона макроинициатором были подучены конъюгаты, активность которых по казеину зависела от М привитого полимера. При М = 500 она составляла 54 % от исходной, но снижалась до 15% при М = 3,5 тыс. Одновременно наблюдалось повышение устойчивости к автолизу в 2— 2,5 раза при слабой зависимости этого параметра от М. Прогрев конъюгатов при 80 °С повышал казеинолитическую активность от 60 до 250 % от исходной в зависимости от М карбоцеп-ных компонентов, достигая максимума через 1—1,5 ч. Это явление, по-видимому, объясняется частичной обратимой денатурацией белка, которая делает его структуру более лабильной.
В случае инсулина (5.19) тот же бифункциональный инициатор (5.20) в диметилформамиде ацилирует две аминогруппы белка, образуя внутримолекулярно сшитый по аминогруппам AI и Б29 инсулин (5.21).
h2n-
h2n-
(5.19)
C1 NH-* [ch3occ(ch3),n=],^
(5.20)
СГН2№=С—NH-(CH3)2C
H2N-
h2n-
R-CH=CII, ------------>
40-60 °C
NH
crhsn=c-c(chs)8-n=n-c(ch2)2-c=nh2 cr
(5.21)
(5.22)
R= F=1
N
IjJH
(СН3)гС—c=nh2 cr
-COOHrCONH8
Добавление N-винилимидазола и нагревание приводят -к разрыву сшивающих связей и росту двух полимерных цепей в указанных точках молекулы белка. Их М составляет 10— 20 тыс. Биологическая активность инсулинового конъюгата (5.22) с поливинилимидазольными цепями составляет около 50 % от исходной, а иммуногенность отсутствует. Это свидетельствует о несовпадении центра физиологической активности и иммунологической детерминанты белка. При полимеризации .других мономеров на том же макроинициаторе получаются конъюгаты (5.22) с активностью до 150 % от исходной и практически полным отсутствием иммуногенности [93]. Во всех случаях увеличение М полимера снижает активность конъюгата.
Перспективы медицинского применения звездообразных конъюгатов с карбоцепными «лучами», по-видимому, благоприятны, так как сохранение активности и отсутствие иммуногенности— как раз те свойства, которые необходимо придать бел-
кам. Если будет окончательно доказана биодеградабельность конъюгатов (это уже показано in vitro [94]) и подтверждена их достаточно длительная циркуляция в кровяном русле, то регулируемость и определенность структуры таких конъюгатов может стать их существенным преимуществом.
Присоединение к белку относительно низкомолекулярных полимеров по одной из их концевых групп приводит к получению звездообразных конъюгатов с белковой глобулой в центре. Такие конъюгаты обладают пониженной антигенностью и увеличенными сроками циркуляции в кровяном русле [95]. О-Ме-тил-О'-дихлортриазинилполиэтиленгликоли с М — 1,9 или
5,0 тыс. были присоединены по аминогруппам альбумина [7] или каталазы [96]. Конъюгат альбумина оказался неспособным распознавать антитела, выработанные к нему или к исходному белку, а конъюгат каталазы с низкомолекулярным полимером (цепи присоединены к 43 % аминогрупп) продуцировал антитела к себе и к исходному ферменту только в некоторых случаях. Такой же конъюгат с высокомолекулярным полимером (модифицировано 40 % аминогрупп) с антителами к ферменту не реагировал. Оба конъюгата каталазы сохраняли 93—95 % первоначальной ферментативной активности. Конъюгат с полимером с М = 5,0 тыс. устойчив к перевариванию трипсином и химотрипсином. При повторном внутривенном введении аката-лазным мышам эти конъюгаты значительно более длительно циркулировали в кровяном русле, чем каталаза (Г1/2 = 48 и 12 ч соответственно, М конъюгата« 335 тыс., каталазы — 242 тыс.). Аналогично синтезирован ряд производных полиэти-лвнгликолей с другими ферментами (трипсином, аргиназой, глутаминазой-аспарагиназой и др.) [97—100]. Молекулярная масса М конъюгатов увеличивалась или уменьшалась в ходе их получения (последнее, видимо, за счет диссоциации на субъединицы). Изучение физико-химических свойств конъюгатов показало, что белковые глобулы покрыты гибкой гидрофильной оболочкой полимера, маскирующей заряд фермента. Все конъюгаты растворимы в воде, даже если исходные ферменты в тех же условиях нерастворимы. Необычным свойством конъюгатов оказалась их способность проникать через биологические мембраны: конъюгаты глутаминазы-аспарагиназы и супероксид-дисму-тазы появлялись в крови после внутрибрюшинного введения мышам в больших количествах, чем исходные ферменты. Конъюгат супероксид-дисмутазы проявил противовоспалительное действие и был более эффективен, чем немодифицированный фермент, а конъюгат глутаминазы-аспарагиназы проявил более сильное противоопухолевое действие, чем нативный фермент.
Синтезированный триазиновым методом конъюгат суперок-®иддисмутазы с полиэтиленгликолем предложен для профилактики аллоксанового диабета [101]. Он циркулирует в кровяном
русле дольше, чем исходный фермент (время полувыведения по активности от 1,5 до 25 ч для конъюгатов с М от 37 до 121 тыс.; исходный полимер имел М — 1,9 или 5 тыс.). На выведение через почки влияет в основном не М полимера, а число модифицированных аминогрупп. Снижение иммуногенности наряду с изменением каталитических свойств и удлинением сроков циркуляции в кровяном русле описано также для звездообразных конъюгатов полиэтиленгликоля с аргиназой печени быка [102], фенилаланин аммиак-лиазой [103], уриказой [104] и другими ферментами [105]. Так, для конъюгата фенилаланин аммиак-лиаза наблюдали 60 % активности исходного фермента при модификации 23 % аминогрупп и лишь 15 % при модификации 52 % аминогрупп. Этот конъюгат слабо реагировал с антителами к нему, но в отличие от остальных описанных здесь конъюгатов оказался хорошим иммуногеном [103].
