Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
О-
sch2ch2coon
/
\
со
J
Б—NH2 Б'—NH2
Б"—S—SCH2CHjCONH—В' *
Б"—SH
Си-
SCH2CHjCONH—Б
Си-
SCHjCH2CONH—Б'
[HSCH2CH(OH)2]2
HSCH2CH2CONH—Б
Б—NHCOCH2CH2S—SCHsCH2CONH—Б'
B-NHCOCH2CH2S—sch2ch2conh—в
Сшивание с образованием дисульфидных связей позволяет в ряде случаев соединять белки так, чтобы реагировали только молекулы разных белков. Для этого в белок, не содержащий доступных тиольных групп, их вводят с помощью различных тиолирующих агентов (гомоцистеинтиолактон, а-меркаптоянтар-ный ангидрид, 2-иминотиолан и т. д.). Активация введенных тиольных групп (аналогично описанному выше) позволяет им взаимодействовать только с неактивированными тиольными группами другого белка с образованием дисульфидного конъюгата (5.32), состоящего из двух разных белков [129].
NH2
Б—NH2+HS (СН2)аСОСН3 Б'—NH2+SS(CH2)2COCH3
I 4и,
О
N
NHj
II
Б—NHC(CH2)2SH ¦Б'—NHC(CH2)2SS
+nh2
nh2
II
Б—NHC(CHa)2—S
I
Б'—NHC(CH2)s—S
J
+nh2
Этим методом получены гомоконъюгаты бычьего альбумина, а также гетероконъюгаты альбумина с нуклеазой, пероксидазой хрена, антителами барана и статистическим сополимером L-глу-таминовой кислоты с L-лизином. Активированный белок содержал от 1 до 5 пиридилдисульфидных групп на макромолекулу, а конъюгаты были в основном ди-, три- и тетрамеры. Конъюгаты пероксидазы с антителами сохраняли более 80 % ферментативной и иммунологической активности. Применение направленного сшивания белков дисульфидными связями приводит к получению конъюгатов более или менее определенной структуры, а сама сшивка может разрываться в организме. Эти свойства благоприятны для белковых конъюгатов, предназначенных для медицинского применения.
Арилазидная группа в отсутствие света практически не реагирует с функциональными группами белка. При освещении происходит фотохимическая реакция, в результате чего образуется нитрен R—N:, который активно взаимодействует с аминогруппами и другими функциональными группами белка. Скорость реакции можно регулировать интенсивностью облучения. К сожалению, высокая активность нитренов приводит к неоднозначному протеканию реакции с белком. Обычно сначала проводят реакцию бифункционального реагента с одним из белков в темноте по алкилирующей или ацилирующей группе, а затем добавляют второй белок и генерируют нитрены при освещении. Некоторые арилазидные бифункциональные реагенты (5.33) приведены ниже [130, 131]:
(5.33)
NH2
II
—SS(CH!)sCOCHs:
—CONHCH2CONHCHCHaCH2SS—/ ^N: —CH2CHO; —SCN
СООН
Имеющийся широкий набор бифункциональных реагентов позволяет химически связать практически любые два белка. Основная задача заключается в получении конъюгата необходимой структуры (число связанных между собой молекул) и селективном проведении процесса по определенным функциональным группам. От того, как решена эта задача, зависят функциональные свойства полученных конъюгатов, их однородность и воспроизводимость свойств.
N3—( X—R
СО
R =_SS(CHj)aCOO—
СО
Как уже отмечалось, сшитые белки нашли применение в ряде областей экспериментальной биологии и медицины. Здесь будут кратко рассмотрены три из них: ферментные конъюгаты для потенциального терапевтического применения в качестве биокатализаторов, ферменты, сшитые с антителами и их фрагментами для иммунологических целей, иммунотоксины — белковые конъюгаты, целенаправленно поражающие опухолевые клетки. Сшитый гемоглобин как кровезаменитель — переносчик кислорода описан в гл. 7.
Применение межмолекулярно сшитых ферментов для терапевтических целей преследует те же цели, что и в случае по-лимер-ферментных конъюгатов: увеличение сроков циркуляции в кровяном русле, снижение иммуногенности и стабилизацию фермента при максимальном сохранении ферментативной активности. В отсутствие полимерной защитной оболочки достижение этих целей более сложно. В то же время нарушение нативной конформации белка при межмолекулярном сшивании обычно меньше, чем при модификации полимерами, содержание белка в конъюгате почти 100%, а внутримолекулярные сшивки ответственны за наблюдаемую в ряде случаев стабилизацию.
Так, сшивание двух молекул панкреатической рибонуклеазы дииминоэфиром субериновой кислоты позволило с выходом да 20 % получить димер всего лишь с одной точкой связывания в каждой макромолекуле [132]. Он оказался в 8,5 раз более активен к двухцепочечной молекуле поли-(А), поли-(У) по сравнению с мономерным ферментом. Уриказа (урат-оксидаза) из свиной печени и аспарагиназа были сшиты глутаровым диальдегидом с альбумином с целью увеличения сроков циркуляции в кровяном русле [133]. Конъюгаты гомологичного альбумина с уриказой оказались не иммуногенны и не антигенны. При М « 500 тыс. они оказались более стабильны к тепловой денатурации и протеолизу, чем исходные ферменты. Сохранение активности in vitro составляло 30 % для уриказы и 80 % для аспарагиназы. Уриказа, связанная глутаровым диальдегидом с тем же альбумином, но в условиях защиты активного центра фермента мочевой кислотой, показала повышенную термостабильность, а оптимум pH был сдвинут лишь незначительно. Если конъюгат получали при pH, соответствующем максимуму активности фермента, то активность в значительной мере сохранялась и при физиологических значениях pH, что указывает на жесткое закрепление наиболее активной конформации. В экспериментах in vivo конъюгат не отличался по активности от свободного фермента в течение ^=7 ч. За это время концентрация конъюгата в плазме оставалась постоянной, и токсические эффекты не наблюдались. Повторные введения конъюгата были столь же эффективны, но в отличие от введения нативного фермента анафилактическая реакция отсутствовала [134]. Конъюгат аспарагиназы с альбумином не проявлял
