Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
Степень сохранения активности в конъюгате
Литера-
турные
ссылки
а-Амилаза (Bacillus Amyloli-quefacteris)
(источник не ука-(сладкий карто-
а-Амилаза зан)
(5-Амилаза фель)
Глюкоамилаза (Fusarinu Sola-ni)
Аргиназа
Аспарагииаза (Erwinia Caroto-vara)
Карбоксииептидаза 1 (Pseudomonas)
Каталаза печени быка а-Химотрипсин
Лизоцим
Рибонуклеаза из поджелудочной железы быка Трипсин
Б 50% 44
Б 42% [45
Б 20-30% [46
В 67% 47
Б 50% [48]
Б 90-100% [48]
Б 45% [49]
А 30% [50]
Б 52% [49]
Б 70% 45
Б 51
А 100% 14
Б --- 16
В 81 % по низкомолеку 52
лярному субстрату,
73% по казеину
Б 51]
А 55]
Б 90-100% 55]
Б 53% по низкомолеку [45]
лярному субстрату,
7% по казеину
Б [51]
Примечание. А — альдегидный метод (с днальдегиддекстраном и последующим восстановлением), В — бромциаиовый, В — хлортриазнновый.
методах активации декстрана увеличение отношения полимер : белок обычно повышает активность, хотя этот процесс не однозначен. Активность декстран-ферментных конъюгатов по отношению к высокомолекулярным субстратам (а к ним относятся, например, тромботические массы) обычно существенно ниже, чем к низкомолекулярным именно за счет декстрановой «оболочки».
Для медицинского применения декстран-ферментных конъюгатов важно не только сохранение ферментативной активности, но также и время циркуляции в кровяном русле после внутривенного введения, снижение антигенности, повышение устойчивости к тепловой денатурации и к расщеплению протеазами. Как уже отмечалось, полимерная оболочка конъюгата, расположенная на периферии белковой глобулы, экранирует антигенные детерминанты белка. В результате удается избежать как индукции биосинтеза антител по отношению к белковой части конъюгата (т. е. иммуногенности), так и взаимодействия конъю-
гата с уже имеющимися по разным причинам в организме антителами к данному белку (т. е. антигенности). Поскольку в медицине используют гетерологичные ферменты из самых разнообразных источников, то иммунный ответ организма на фермент представляет собой серьезную проблему.
Из-за отсутствия собственной антигенности, а также относительной жесткости макромолекул декстран особенно подходит для получения неиммуногенных и неантигенных конъюгатов. Так, конъюгаты антигена Е пыльцы крестовника с диальде-гиддекстраном, содержащие от 2 до 5 молекул полимера на моль белка («70% белка от массы полимера) в 7—8 раз менее антигенны и аллергенны для сенсибилизированных больных, чем исходный белок [53]. При этом М конъюгатов ниже ожидаемой за счет распада декстрана в процессе получения ди-альдегидного производного. Обработка конъюгатов декстрана-зой приводит к возвращению антигенной активности в результате разрушения экранирующей оболочки. В опытах на кроликах, однако, конъюгат вызывает образование антисывороток как против белка, так и против декстрана.
Отмечалось, что конъюгаты высокомолекулярного декстрана с а-амилазой и каталгзой слабее реагируют с антителами к исходному ферменту, чем сам нативный фермент, и их иммуно-генность также уменьшается [54—56]. Аллергенный ответ на соответствующий конъюгат у морских свинок, сенсибилизированных а-амилазой, отсутствует, хотя оба конъюгата иммуно-генны (но на низком уровне).
Важность использования относительно высокомолекулярных декстранов показана в работе [57]. Конъюгаты декстрана (Mw = 4,4 тыс.) с различными альбуминами, полученные бром-циановым методом и содержащие 3—31 % полисахарида, оказались иммуногенными для разных видов животных при повторных введениях в присутствии адъюванта. В отличие от конъюгатов, богатых полисахаридом, в данном случае роли меняются: декстран выступает как гаптен, а альбумин — как полимерный носитель.
Если конъюгат содержит много полисахаридов (например, 89 %, как в случае трипсин-декстранового конъюгата [45, 49]), то термическая стабильность и устойчивость к протеолизу обычно повышаются. Так, конъюгат а-амилазы, полученный бром-циановым методом, имеет Тi/2 при 65 °С около 60 мин по сравнению с 2,5 мин для нативного фермента [54]. Для конъюгата Р-амилазы Tx/2 при 60°С составляет 175 мин вместо 5 мин для самого фермента. Аналогично обстоит дело и в случае конъюгатов, полученных триазиновым методом [47, 52]. Одновременно повышатся устойчивость к денатурации меркаптоэтанолом, до-децилсульфатом и этилендиаминтетрауксусной кислотой [46]. Повышение устойчивости к протеолизу часто идет параллельно с термостабилизацией. Упомянутый выше конъюгат не теряет
активности в течение двухчасовой инкубации с трипсином, в то время как исходный фермент сохраняет ее только на 29 %• Одновременно ослабляется способность к ингибированию трипсина его высокомолекулярным ингибитором. Активность ферментов по отношению к высокомолекулярным субстратам также снижается (для декстрановых конъюгатов лизоцима, а-химотрип-сина и трипсина [51, 58]). Стабилизация белков в декстрановых конъюгатах в целом выше, чем в конъюгатах с синтетическими полимерами или в звездообразных конъюгатах с полиэтилен-гликолем (см. ниже).
