Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
5.2. КОНЪЮГАТЫ БЕЛКОВ С ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ПОЛИМЕРАМИ-НОСИТЕЛЯМИ
Синтетические полифункциональные полимеры-носители не особенно часто используются для связывания белков из-за гидро-фобности их главной полимерной цепи и отсутствия биодеструктируемости. В то же время важное преимущество таких полимеров заключается в том, что в большинстве случаев можно избежать сшивания макромолекул полимера-носителя при активации.
Трипсин и химотрипсин, связанные с поливинилпирролидо-ном, с М = 10 тыс. (5.1) были получены по следующей схеме [21]:
—CHjCH—'
N
Г
^СО
ОН“
<•
—CHjCH-
I
N
П°
-Г—СН2СН-
t. НСНО + NaBH4
СО
СН2СН—'
А
Ч|
т
HN(CHa)3COOH Jу 2 ho-n^ 1+
со
+ (CeHuN=)jC Б—NHS
|/^СО
CHjCH-
N(CH,)SC001 ^Нз СО
СО
<)
“---CHjCH---" --- - СН2СН
1 1
N N(CH3)3CONH---Б
^^СО 1
Г I _ X СН8 _у
(5.1)
Фиксация ферментов на этом полимере приводит к исчезновению более 2/3 свободных аминогрупп. Конъюгат (5.1) с трипсином имел М = 150 тыс. и обладал 160 % активности исходного фермента по отношению к низкомолекулярным субстратам, но только 20 % активности по отношению к высокомолекулярным субстратам, и был устойчив к автолизу. Для конъюгата химопжнеина (5.1) эти величины составляли 50 и 7 % соответ-ствеД^
Известно, что каликреины вызывают снижение кровяного давления за счет активации превращения кининогенов в кинины. Однако возникающая в результате взаимодействия каликреи-
fob с ингибиторами плазмы крови гипотензия весьма кратковременна. Для продления эффекта каликреин (М№ = 24 тыс.) был присоединен описанным выше методом к поливинилпнрро-лидону с Mw — 32 тыс. [22]. Специфическая активность конъюгата (Mw= 114 тыс.) оказалась в 4,6 раза меньше, чем у нативного каликреина, а константа Михаэлиса изменилась незначительно. При внутривенном введении животным время действия конъюгата было то же, что и у исходного каликреина, и, следовательно, полимер не препятствовал взаимодействию каликреина в конъюгате с ингибитором. В то же время p-D-ацетил-гексозаминидаза А, присоединенная к поливинилпирролидону тем же методом с целью создания средства для лечения ферментно-дефицитных больных [23], циркулировала в кровяном русле почти в 40 раз дольше, чем исходный фермент (через 48 ч циркулировало 20 % конъюгата, в то время как немоди-фнцированный фермент полностью исчезал за 1 ч). Полученный конъюгат с М — 200 тыс. содержал 8 % белка, имел повышенную на 20 % (по сравнению с исходным ферментом) активность по отношению к субстрату и неизменную константу Михаэлиса. Устойчивость конъюгата при нагревании, а также в кислой среде была такой же, как у исходного фермента, а стабильность к проназе и катепсинам макрофагов значительно повышена. Иммунологическая специфичность конъюгата заметно отличалась от специфичности исходного фермента. Конъюгат очищенного аллергена пыльцы крестовника с полнвинилпирро-лидоном не вызывал специфического ответа у мышей, что говорит о том, что аллерген надежно экранирован полимером [24].
Приведенный выше метод введения функциональных групп в поливинилпирролидон слишком сложен. Более простой путь к таким конъюгатам заключается в использовании сополимеров винилпирролидона и других гидрофильных мономеров с функциональными мономерами. Так, окрашенный растворимый полимерный конъюгат карбоангидразы (5.2) был получен азид-ным методом из фермента и полимера-иосителя («Хромоэнз-акрнла»), выпускавшегося в промышленном масштабе [25]:
[—CHjCH------"I—Г — СН2СН-------------------1—Г — СН2СН---1
CONH— bJ* L ioNHNHS02C6H2(N02)3Jj, [ CONHjJ?
(5.2)
Соотношение акриламидных и акрилоилгидразидных звеньев в полимере-носителе составляет 10: 1, причем только небольшая часть звеньев второго типа используется для присоединения хромофора, а остальная — для связывания фермента. Квнъюгат (5.2) весьма активен (активность при pH = 8,0 в раз
выше, чем у нативного фермента) и стабилен (78—8^j сохранения активности при pH = 8,0 и 60°С вместо 12 % у нативного фермента); хранение при 2°С в течение нескольких недель на
активность не влияет. Помимо конъюгата карбоангидразы синтезированы также хромоконъюгаты ацилазы и пероксидазы.
Конъюгаты химотрипсина с поли-N-(2-гидроксипропил) метакриламидом (Мто = 90тыс.) (5.3) и (5.4) синтезированы соответственно трихлортриазиновым или азидным методом, а конъюгат (5.5) с сополимером того же мономера с метакрилоилдигли-цином (Mw — 13 тыс.) методом активированных п-нитрофе-ниловых эфиров [26]:
