Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Дальнейшее развитие этого направления исследований привело к созданию искусственных хромосом животных (MAC -mammalian artificial chromosome) и человека (НАС - human artificial chromosome) с помощью которых оказалось возможным введение протяженных фрагментов ДНК в дифференцированные и эмбриональные стволовые клетки.
3.4.1. Сверхъемкие векторы YAC, ВАС и РАС
Плазмиды дрожжей. В ядрах клеток большинства штаммов дрожжей S. cerevisiae присутствует плазмидная ДНК в виде двухцепочечных кольцевых ковалентно замкнутых молекул в количестве 30-100 копий на клетку, что может составлять до 5% от суммарной ядерной ДНК. Плазмиды получили название 2|дт. Клетки, содержащие такие плазмиды, обозначают cir+, а бесплазмидные клетки - cir°. Единственное фенотипическое различие между клетками этих двух типов заключается в том, что скорость деления сп^-клеток незначительно меньше, чем cir°. В этой связи плазмиды 2цт рассматривают как внутриклеточные паразиты, и эти свойства отличают их от плазмид других грибов, которые, как правило, кодируют белки, необходимые для жизнедеятельности
^якроорганизмов-хозяев. Стабильное существование плазмид 2рт в клетках, как и в случае бактериальных плазмид, требует функционирования механизмов их автономной репликации, контроля числа копий и распределения между дочерними клетками.
Присутствующие в плазмидах последовательности ARS (autonomously replicating sequence) необходимы для инициации репликации плазмидной ДНК, которая осуществляется с участием белков клетки-хозяина. Однако таких последовательностей самих по себе недостаточно для стабильного существования плазмиды в клетках дрожжей, и для этого требуется функционирование четырех дополнительных генов. Один из них, FLP, кодирует рекомбиназу, которая при некоторых обстоятельствах может увеличивать число копий плазмид внутри клеток, хотя здесь, как обычно, сохраняется только одна инициация репликации плазмиды в каждой S-фазе клеточного цикла. Два других гена REP1 и REP2 кодируют белки-репрессоры гена FLP, а ген RAF кодирует антирепрессор, и его активность негативно регулируется комплексом белков Replp/Rep2p.
Векторы для клонирования ДНК в клетках дрожжей. Вышеперечисленные особенности биологии плазмид 2цш учитываются при конструировании соответствующих векторов и искусственных хромосом YAC. Современные дрожжевые векторы представлены несколькими семействами.
Плазмидные интегрирующие векторы дрожжей YIP (yeast integrative plasmids) предназначены для встраивания клонированных фрагментов ДНК в клетки дрожжей. Эти векторы не реплицируются автономно в клетках дрожжей, но обладают селектируемыми маркерами, обеспечивающими рост клеток в селектирующих условиях. Они способны реплицироваться в клетках Е. coli. Остальные нижеперечисленные векторы относятся к челночным векторам, т.е. способны реплицироваться в бактериальных и дрожжевых клетках. Дрожжевые реплицирующиеся плазмиды YRP (yeast replicating plasmids) содержат область начала репликации ARS, в отсутствие селектирующего агента существуют в дрожжевых клетках крайне нестабильно. В отсутствие селекции в каждой генерации утрачивается, как правило, >1/10 всех Молекул плазмид. Дрожжевые эписомные плазмиды YEP (yeast episomal plasmids) сконструированы на основе природной плазмиды 2 цт. Они присутствуют в клетках в большом числе копий и наследуются значительно более стабильно, чем плазмиды семейства YRP. Дрожжевые плазмиды, содержащие центромеры YCP (yeast centromeric plasmids) содержат последовательности 'ARS и CEN. Последнее обстоятельство делает их в отсутствие спе-
Рис. 10. Схема клонирования сверхдлинных молекул ДНК с использованием вектора YAC (а) и их изменение с помощью ретрофиттинга (б) [105 а]
а - клонирование ДНК в данном YAC-векторе включает три основных этапа: 1 - линеаризацию ДНК вектора рестриктазой ВатН1\
2 - расщепление линеаризованной ДНК вектора рестриктазой EcoRl с образованием “плеч”; 3 - введение в вектор клонируемого EcoRl-фрагмента ДНК;
б - введение мутаций в ген, клонированный в YAC-векторе, методом ретрофиттинга. Вначале в YAC-векторе со вставкой инактивируют его исходный селектируемый маркер URA3 путем введения в этот ген последовательностей новых селектируемых маркеров LYS2 и Neo посредством гомологичной рекомбинации между YAC-вектором и соответствующей плазмидой; на втором этапе с помощью линеаризованной дрожжевой интегрирующей плазмиды во вставку YAC-вектора вместе с маркером URA3 вводят мутантную последовательность (ш); после интеграции плазмиды (pop-in) образуется тандемная дупликация модифицируемого гена, в которой присутствуют исходный и мутантный гены; при выращивании клеток дрожжей без селекции по маркеру URA3 одна из копий гена спонтанно и равновероятно утрачивается с низкой частотой вместе с маркером в результате гомологичной рекомбинации (pop-out)
циальных селективных условий в 10-100 раз более стабильными по сравнению с изогенными (во всем остальном идентичными) плазмидами без CEN-последовательностей. Векторы этой серии были использованы для создания искусственных хромосом дрожжей.
