Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 32

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 221 >> Следующая

t J +
L -С-• )
Штамм 1 Штамм 2
и Упаковочный
экстракт
JZZ2
Вектор со вставкой Упаковка
Рекомбинантный фаг
„ „ о\
D Z и, о 0_
a AW В С EF UVCTHMLKI J JS* dpyNrex trpE NSoOPQ SR.
I гг~~1"~лг ifI'l-iL и i и i m rmn ni • i ппгпп m ГеНы
6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 %X
1-------------1-------------f1-------------1-------------1--------------1-------------1-------------1--------------*i----------H
10 20 30 40 т.п.о.
в
SBR RBS
'X.___________________________EMBL3
частицы с упакованными в них рекомбинантными молекулами ДНК, так и все продукты, появляющиеся в результате экспрессии клонированных бактериальных генов. Каждая бляшка возникает вследствие развития индивидуальной фаговой частицы, содержащей рекомбинантную ДНК только одного типа, а, следовательно, все фаговые частицы одной бляшки (~1010) представляют собой, как правило, клон идентичных фаговых частиц (они могут различаться в редких случаях за счет мутационных изменений их генома, произошедших в процессе жизненного цикла фага, либо в том случае, если одна бактериальная клетка заражается несколькими фаговыми частицами одновременно). Все это позволяет легко обнаруживать в фаговых бляшках искомые ферментативные активности или последовательности нуклеотидов и идентифицировать клонированные последовательности ДНК. Основой конструирования фаговых векторов служат несколько простых принципов (рис. 7). В середине молекулы Х-ДНК длиной -45 т.п.о. расположен участок хромосомы (-15 т.п.о.), который не является необходимым для литического развития бактериофага. Поэтому, в
принципе, его можно заменить на любой фрагмент ДНК аналогичного размера и осуществить клонирование фрагмента путем размножения рекомбинантного бактериофага. Поскольку механизм упаковки хромосомной ДНК в фаговые частицы основан на включении ДНК строго определенного размера, рекомбинантные ДНК, содержащие фрагменты клонируемой ДНК, которые не соответствуют оптимальному размеру, не упаковываются и не клонируются. Это позволяет легко освобождаться от фаговых частиц, не содержащих вставки клонируемой ДНК, и оптимизировать процесс клонирования путем снижения в упаковочных экстрактах доли нежизнеспособных фаговых частиц.
Процесс упаковки фаговой ДНК в зрелые фаговые частицы осуществляется в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов Е. coli, лизогенных по дефектным бактериофагам X. Обычно в одном штамме амбер-мутацией инактивирован один из белков фагового капсида (продукт гена Е), а в другом - ген Л, продукт которого необходим для включения фаговой ДНК в головку бактериофага. Имеются и другие пары лизогенных штаммов Е. coli, позволяющие производить упаковку ДНК в фаговые частицы с использованием тех же общих принципов. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов Е. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций с помощью соответствующих белков дикого типа. Таким образом, в объединенных экстрактах имеются все компоненты, необходимые для сборки зрелых инфекционных фаговых частиц, в них происходит упаковка рекомбинантной ДНК с эффективностью образования 104— 105 фаговых частиц на 1 мкг упаковываемой ДНК. Помимо вышеупомянутых мутаций ДНК Х-лизогенов содержат температурочувствительную мутацию в репрессоре cl, который инактивируется после переноса лизогенных клеток Е. coli на непермис-сивную температуру (42 °С), что сопровождается индукцией профага X и накоплением внутри бактериальных клеток белковых продуктов, необходимых для упаковки ДНК. ДНК профагов также содержит делецию Ь2, элиминирующую сайт att, требуемый для интеграции фаговой ДНК в бактериальную хромосому. Это предотвращает выход ДНК профага из бактериальной хромосомы, а следовательно, и ее упаковку in vitro. Кроме того, в хромосоме профага имеется мутация, инактивирующая ген S, кодирующий лизоцим, что препятствует преждевременному лизису бактериальных клеток после индукции профага и позволяет сконцентрировать бактериальные клетки перед получением упаковочных экстрактов. И, наконец, бактериальные лизогенные клетки содержат мутацию reck, которая предотвращает гомологичную ре-
комбинацию между ДНК профага и рекомбинантными ДНК, упаковываемыми в фаговые частицы.
В качестве примера рассмотрим генетическую карту векторной ДНК бактериофага X-EMBL и кратко обсудим возможности этого вектора (рис. 8). Векторы серии EMBL являются производными ДНК бактериофага XI059. Их хромосомная ДНК длиной в 42364 п.о. содержит центральный сегмент ДНК длиной ~15 т.п.о., который замещается на клонируемый фрагмент ДНК соответствующего размера. При этом в фаговые частицы может быть упакована рекомбинантная ДНК общей длиной в 9-23 т.п.о. Замещаемый фрагмент фаговой хромосомы фланкирован с обоих концов последовательностями полилинкера, содержащего рестриктазные сайты EcoRl, BamHl и SalGl, по которым встраивают клонируемые фрагменты ДНК. При этом во время подготовки вектора к работе нет необходимости отделять “плечи” вектора от центрального фрагмента. Сначала центральный фрагмент ДНК выщепляется рестриктазой по одному из сайтов полилинкера, а затем смесь образовавшихся фрагментов обрабатывается другой рестриктазой, сайт для которой находится в полилинкере. Возникающие при этом олигонуклео-тидные фрагменты полилинкера удаляются при переосаждении ДНК спиртом, а липкие концы “плеч” вектора и центральной последовательности получаются некомплементарными друг другу и не могут объединяться в процессе лигирования с образованием исходной формы ДНК вектора.
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed