Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Еще одним важным для генной инженерии свойством плазмид является консервативность их размера. Минимальный размер плазмиды диктуется необходимостью расположения в ее молекуле всех генов и регуляторных последовательностей, необходимых для поддержания ее внутриклеточной автономии. Другое требование, которое необходимо соблюдать при конструировании искусственных плазмид - это близкое друг к другу расположение взаимозависимых регуляторных участков молекулы. Это необходимо для обеспечения высокой вероятности их совместной передачи в дочерние клетки. Повышение размера плазмиды сверх оптимального будет отрицательно сказываться на ее стабильности. Случайно возникающие в популяции бактерий мутантные формы плазмиды меньшего размера будут реплицироваться быстрее, и постепенно бактериальные клетки с мутантными плазмидами вытеснят клетки с исходными молекулами.
И, наконец, в завершение этого раздела, необходимо вспомнить о совместимости разных плазмид в бактериальных клетках. Различные близкородственные плазмиды, как правило, не могут длительное время сосуществовать друг с другом в клетках потомства исходной их содержащей бактериальной клетки [100]. В результате после некоторого количества клеточных делений в дочерних клетках остается только один вид плазмид из нескольких первоначально в них присутствующих. Это свойство плазмид называется несовместимостью. Считается, что две плазмиды относятся к разным группам несовместимости, если они способны стабильно сосуществовать в одной бактериальной клетке. Причина несовместимости близкородственных плазмид в бактериальных клетках проста: все они обладают одним и тем же или очень похожим механизмом контроля числа их копий. Если ре-прессор одной плазмиды будет подавлять репликацию другой и наоборот, решение о том, какая плазмида будет реплицироваться в данное время, будет приниматься случайно, что с большой вероятностью будет приводить к изменению их соотношения. В том случае, если это соотношение изменится, например, до 3 : 1, а сами плазмиды окажутся неразличимыми по поведению при сегрегации в дочерние клетки, они будут утрачиваться случайным образом, независимо друг от друга, и одна из плазмид может быть полностью потеряна во время следующего клеточного
деления. Тот же механизм будет функционировать и при распределении многокопийных плазмид, таких как pBR322, между дочерними клетками, поскольку их передача в дочерние клетки осуществляется случайным образом. Эти особенности биологии плазмид объясняют, почему, несмотря на наличие возможности одновременного проникновения в бактериальные клетки во время их трансформации нескольких рекомбинантных плазмид, отдельные рекомбинантные клетки содержат плазмиды только одного вида. Одновременно все это еще раз указывает на необходимость соблюдения в своей экспериментальной деятельности золотого правила микробиологии - всегда начинать работу с бактериальными штаммами после их рассева до отдельных колоний.
Плазмиды серии pBR как основа для конструирования плаз-мидных векторов. Большая серия векторных плазмид, обозначенных символом pBR, создана на основе репликона природной плазмиды ColEl, придающей клеткам ~Е. coli устойчивость к коли-цину путем его объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Таким образом, бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды, приобретают устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко отличить от бес-плазмидных клеток путем простого посева на питательную среду с антибиотиками. Генетическая карта одного широко распространенного вектора этой серии - pBR322 изображена на рис. 6, а. Такая плазмида представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной 4363 п.о. Последовательность нуклеотидов pBR322 полностью известна. Плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину (Тс) и ампициллину (Ар), которые были перенесены в плазмиду pBR322 из плазмиды pSClOl и транспозона ТпЗ, соответственно. Оба этих гена являются селектируемыми генетическими маркерами плазмиды, т.е. позволяют проводить отбор бактериальных клеток с плазмидой pBR322 по их способности к росту на питательных средах в присутствии тетрациклина и(или) ампициллина. Плазмида pBR322 содержит также обеспечивающий ее стабильную репликацию в клетках Е. coli участок ДНК, который включает область начала репликации (ori). Характерной чертой плазмиды pBR322, как и любого современного вектора, является наличие в ней нескольких уникальных сайтов рестрикции, обозначенных на генетической карте. Следует иметь в виду, что встраивание в плазмиду клонируемых чужеродных фрагментов ДНК по сайтам рестрикции, расположенным в генах Ашрг или Тсг (например, Pstl или ВатНI), будет нарушать целостность этих генов и их функциональную активность. В результате происходит утрата бактериальными клет-
ками, содержащими рекомбинантные плазмиды, устойчивости к соответствующим антибиотикам. По такому признаку легко различить бактериальные клетки, не содержащие плазмиды (не растут в присутствии ампициллина и тетрациклина), клетки с плазмидой, не содержащей вставки клонируемой ДНК (растут в присутствии обоих антибиотиков), и клетки с рекомбинантными плазмидами (в зависимости от локализации вставки могут расти на среде только с одним из двух вышеупомянутых антибиотиков). Следовательно, наличие в векторных молекулах селектируемых маркеров резко повышает эффективность клонирования из-за возможности проведения быстрого отбора рекомбинантных плазмид на селективных питательных средах.
