Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 35

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 221 >> Следующая

Искусственные хромосомы дрожжей YAC. Первые минихромосомы дрожжей были получены А. Мюрреем и Дж. Шостаком в 1983 г. Мини-хромосомы дрожжей YAC представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие большинство вышеупомянутых генетических элементов, которые позволяют им стабильно существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей (рис. 10). Типичный вектор включает в себя две теломерные последовательности нуклеотидов TEL (Tetrahymena), необходимые для репликации концов мини-хромосомы, и область начала репликации ARS1, соединенную с последовательностью центромеры (CEN). Все эти функциональные элементы требуются для репликации YAC-вектора и его
CEN4
Ваш
1 Расщепление ВатШ
2 Расщепление EcoRl
TEL TRP CEN4 TEL
---1 I I h-П ?—O-
ARS1 URA3
3 Лигирование с крупными ?coRI - фрагментами ДНК
Искусственная хромосома дрожжей со вставкой 100-700 т.п.о.
LYS2/NE0
TEL TRP1/ARS1/CEN4 Вставка нового селектируемого маркера с помощью гомологичной рекомбинации (ретрофиттинг)
LYS2/NEO
TEL TRP1/ARS1/CEN4
Интеграция плазмиды, содержащей мутантную копию экзогенной ДНК ("pop-in)
X
UR АЗ
LYS2/NEO TEL
TEL TRP1/ARS1/CEN4
Мутантная копия UR А ? Копия дикого типа
о
LYS2/NEO TEL
Гомологичная рекомбинация между двумя копиями эзогенной ДНК ("pop-out")
TEL TRP1/ARS1/CEN4 Мутантная копия LYS2/NEO TEL
Рис. 10 (окончание)
правильной передачи в дочерние ядра во время митоза. Кроме того, вектор содержит два селектируемых маркера TRP, восстанавливающих способность к росту ауксотрофных по триптофану клеток дрожжей в отсутствие экзогенного триптофана, а также маркер URA3, компенсирующий генетический дефект клеток дрожжей, который нарушает биосинтез урацила. В векторе имеется ген супрессорной тРНК SUP4 селектируемого маркера, используемого для супрессии охр-мутаций в клетках дрожжей: мутации сап\-\00 в гене, обеспечивающем устойчивость клеток к L-канаванину (токсичный аналог L-аргинина), мутации ade2-1, что сопровождается восстановлением нормального белого цвета колоний у красных мутантов, и Др. Поскольку в гене SUP А имеется уникальный сайт рестрикции EcoRl, введение клонируемой ДНК по этому сайту инактивирует ген и приводит к приобретению колониями дрожжей красного цвета, как следствие накопления в мутантных клетках метаболитов-пред-Шественников аденина. Векторы семейства YAC являются челночными, т.е. обладают последовательностями нуклеотидов, необходимыми для их репликации в бактериальных клетках.
При подготовке к клонированию YAC-вектор, выделенный в ВиДе плазмиды из бактериальных клеток, расщепляют рестрик-тазой ВатШ и отделяют от образовавшегося короткого фраг-
мента ДНК, который не требуется для репликации YАС-вектора в дрожжах (этап 1, рис. 10, а). После этого проводят второе расщепление вектора рестриктазой ЕсоШ, сопровождающееся образованием двух его “плеч”, каждое из которых на одном из концов содержит теломерные последовательности хромосомы дрожжей (этап 2). На заключительном этапе (3) полученные “плечи” лигируют с крупными iscoRI-фрагментами клонируемой ДНК, которые получают путем частичного расщепления высокомолекулярной хромосомной ДНК, предназначенной для клонирования. Полученными таким образом рекомбинантными ДНК трансформируют протопласты клеток дрожжей, и образовавшиеся трансформанты отбирают на селективной твердой питательной среде по комплементации мутаций trpl и игаЗ, что свидетельствует о присутствии в рекомбинантной конструкции обоих плеч вектора. Для стабильного существования в клетках дрожжей и правильной передачи дочерним клеткам существенным оказывается размер искусственных хромосом. В таких векторах удается осуществлять клонирование фрагментов ДНК длиной до 2 млн п.о., что значительно превышает емкость космид (50 т.п.о.).
Векторы YAC, содержащие клонируемые последовательности, существуют в среднем в виде одной копии на клетку, и даже в отсутствие селектирующих условий утрачиваются с очень низкой частотой (10~3— 10~5 за клеточную генерацию). При увеличении общего размера вектора до 140 т.п.о. и выше частота потери его молекул не превышает таковую, характерную для обычных хромосом дрожжей.
Клоны, полученные с использованием векторов YAC, могут быть модифицированы в дрожжевых клетках с помощью гомологичной рекомбинации методом так называемого “ретрофиттин-га” (retrofitting), что создает условия для изменения далее самой клонированной последовательности (рис. 10, б) [105а,б]. Для проведения ретрофиттинга клетки, содержащие YAC с клонированной последовательностью, трансформируют последовательностью ДНК (кассетой генов), содержащей подходящий генетический маркер, например ген LYS2 или Neo, фланкированный короткими последовательностями, идентичными участкам ДНК одного из маркеров, например, URA3, присутствующих в искусственной хромосоме. Ген Neo, обеспечивающий устойчивость клеток к антибиотику неомицину, часто используется при отборе трансформантов клеток животных. Гомологичная рекомбинация между соответствующими последовательностями кассеты генов с новыми генетическими маркерами и URA3 приводит к интеграции новых маркеров в ген URA3 и инактивации последнего. В результате появляется возмож-
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed