Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
3.3. Космиды и фазмиды
Как уже упоминалось выше, фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.о. Однако этого явно недостаточно, чтобы клонировать целиком многие гены животных и растений, длина которых зачастую превышает 35-40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами (рис. 9). Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены aw-сайты ДНК фага X. Отсюда происходит название всего типа данных векторов (cosmid). В ДНК нормальных фаговых частиц сш-сай-ты расположены на концах молекул, они разделяют мономеры фаговой ДНК в конкатемерах, объединяющих несколько соединенных “голова к хвосту” мономеров, которые являются предшественниками зрелых фаговых ДНК перед упаковкой в фаговые Частицы. В таких конкатемерах соседние сш-сайты располагают-
Геномная ДНК
ВатШ
Частичное расщепление Mbol с образованием фрагментов длиной 35-45 т.п.о.
Расщепление вектора ВатШ и Smal с образованием "плеч"
ori Аг
В
Кг —I
В S
ori Кг
В S
ori Аг
3 ori Аг ¦
S ^ Кг
кг—в S
Непродуктивное лигирование "плеч" вектора
Очистка фрагментов
Лигирование
38-52 т.п.о.
oriAr 1 Kr
t-«-rWY' “s ^
S ^ Kr
s
^ ori Ar s
-nrVY>|-
S ori Аг "чг
Упаковка ДНК in vitro
Y V Y Y
Рис. 9. Космидный вектор и конструирование клонотеки геномной ДНК на его основе
ся на расстоянии 35^5 т.п.о. друг от друга и заключают между собой весь фаговый геном. В процессе упаковки сш-сайты узнаются компонентами ферментативной системы и по ним происходит последовательное отделение (отрезание) упакованной в фаговую частицу А,-ДНК от остальной неупакованной ДНК конка-темера. Таким образом, наличие cos-сайтов в ДНК является, по
существу, единственным необходимым условием упаковываемо-Ьти ДНК в фаговые частицы. Это означает, что последовательность нуклеотидов Х-ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, которая заключает в себе весь фаговый геном (35-45 т.п.о.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине (38-52 т.п.о.) фрагмент чужеродной ДНК и эффективно упакована в фаговые частицы (такова максимальная емкость головки фага). Естественно, что такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной.
Однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 т.п.о. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то, что емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев Ю5-106 колоний на 1 мкг клонируемой ДНК. При такой эффективности упаковки требуется всего лишь 2-4 мкг клонируемой ДНК для получения полной клонотеки большинства эукариотических геномов.
Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для Х-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий.
3.4. Искусственные хромосомы
Хромосомы высших организмов содержат в своем составе протяженные молекулы ДНК. Например, длина ДНК одной из типичных хромосом человека составляет 100-200 млн п.о. Исследование генов в хромосомах высших растений, животных и человека, в том числе и полное секвенирование их геномов, потребовало создания векторов для клонирования фрагментов ДНК длиной в несколько сотен тысяч пар оснований. Этой задаче отвечают недавно созданные системы для клонирования сверхдлинных молекул ДНК на основе искусственно полученных мини-хромосом дрожжей (YAC -yeast artificial chromosome), бактерий (ВАС - bacterial artificial chromosome) и бактериофагов (РАС - PI phage-derived artificial chromosome). Разработка таких векторов позволила не только сделать реальным определение полной первичной структуры больших геномов, но и открыла новые возможности для получения трансгенных соматических клеток человека, животных и растений. Создание этих технологий, в свою очередь, оказало глубокое влияние на приложения биотехнологии в молекулярной биологии и генетике (исследование экспрессии и функций индивидуальных генов), медицине (генотерапия) и сельском хозяйстве (трансгенные животные и растения с новыми потребительскими свойствами).
