Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
цость его повторного введения в клонированную последовательность YAC в качестве селектируемого маркера вместе с новыми последовательностями, изменяющими исходную. Ретрофиттинг позволяет преодолевать технические сложности, которые возникают при необходимости проведения генно-инженерных манипуляций с протяженными последовательностями нуклеотидов, клонированными в YAC-векторах, т.к. исключает необходимость использования рестриктаз и лигирования, обычно применяемых для этих целей при работе с более короткими последовательностями.
Использование YAC для получения клонотек нуклеотидных последовательностей. При создании искусственных хромосом дрожжей in vitro в среднем удается клонировать фрагменты ДНК длиной ~300 т.п.о. Однако с помощью гомологичной рекомбинации, проводимой непосредственно в клетках дрожжей, можно получать вышеупомянутые вставки в несколько млн п.о. Для реализации полной емкости вектора используют предварительно полученные YAC-конструкции, в которых клонированы частично перекрывающиеся последовательности. Для обнаружения перекрывающихся клонов используют рестрикционное картирование с гибридизацией по Саузерну, метод “прогулки по хромосоме” и ряд других стандартных методов исследования генома, которые будут рассмотрены во втором томе этой книги. После обнаружения таких перекрывающихся клонов проводят скрещивание гаплоидных клеток, содержащих требуемые YAC, в полученных диплоидных штаммах индуцируют мейоз, при котором с высокой частотой возникают требуемые рекомбинантные YAC с протяженными непрерывными последовательностями - контигами - исследуемого генома. Для предотвращения образования в результате рекомбинации дицент-рических и ацентрических YAC, которые нестабильны, объединяемые вставки должны быть клонированы в одной и той же 5' -» 3'-ориентации по отношению к маркерам вектора. После завершения клетками мейотических делений и споруляции в спорах обнаруживают требуемые рекомбинанты, конечная длина которых после проведения серии последовательных скрещиваний может превышать 2 млн п.о. [105, в].
Получение трансгенных животных с использованием YAC. После проведения вышеупомянутого ретрофиттинга для введения селектируемых маркеров, применяемых при отборе трансформированных клеток животных, модифицированные таким образом YAC со вставками исследуемых последовательностей могут быть Использованы для получения трансгенных животных. Очищенные Молекулы рекомбинантных YAC можно вводить в пронуклеус Яйцеклеток с помощью микроинъекции или липофекции.
При всех своих достоинствах системы клонирования, основанные на векторах семейства YAC, обладают рядом существенных недостатков. На стабильность YAC-векторов в дрожжевых клетках оказывает влияние их генотип. Так, потеря вектора происходит с высокой частотой в клетках, содержащих мутантные гены BUB1, BUB2 и BUB3, MAD1, MAD2 и MAD3, CDC6, CDC20, PDS1 и др. Кроме того, стабильная сегрегация вектора в дочерние клетки происходит лишь в том случае, если вставки клонируемой ДНК не содержат последовательностей, гомологичных последовательности ARS, чего нельзя полностью исключить при клонировании больших фрагментов эукариотической ДНК с неизвестной первичной структурой.
В рекомбинантных ДНК, поддерживаемых в таких системах, часто возникают внутренние делеции некоторых, например, повторяющихся последовательностей. Кроме того, при введении рекомбинантных ДНК в клетки дрожжей иногда имеет место проникновение в одну клетку нескольких молекул вектора со вставками. В итоге отдельные клоны дрожжевых клеток могут содержать несколько несцепленных друг с другом молекул рекомбинантных ДНК, а рекомбинация между ними вообще может приводить к образованию химерных молекул, которые являются одной из главных проблем, возникающих при использовании YAC: 40-60% клонов могут содержать химерные молекулы. Все это очень затрудняет физическое картирование генов в хромосомах исследуемых объектов.
Искусственные хромосомы бактерий. Для преодоления трудностей, возникающих при использовании искусственных хромосом дрожжей, были сконструированы альтернативные векторные системы, среди которых наиболее популярными в настоящее время являются системы, основанные на искусственных хромосомах бактерий-ВАС (bacterial artificial chromosome) [106]. В векторных системах ВАС используется ДНК полового фактора СF-фактора) Е. coli - гигантской плазмиды мужских бактериальных клеток, которые являются донорами бактериальной ДНК при конъюгации с женскими клетками (рис. 11). Типичный F-фактор содержит гены oriS, repE, par А и рагВ, регулирующие собственную репликацию и контролирующие число копий в бактериальных клетках. В частности, гены oriS и герЕ обеспечивают однонаправленную репликацию F-фактора, а гены par А и рагВ поддерживают число его копий на уровне одной-двух на бактериальную клетку. Классический вектор ВАС (pBAC108L) включает в себя все эти гены и ген устойчивости к хлорамфениколу, используемый в качестве селектируемого маркера. Вектор содержит также фрагмент
рис. 11- Представители семейств ВАС- {а) и РАС- (б) векторов
