Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
3.1. Плазмидные векторы
Первые эффективные векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК, не утратившие своего значения и поныне, были получены с использованием бактериальных плазмид. И се-
годня векторы на основе плазмид чаще всего используются в мо-лекулярно-генетических исследованиях. Целый ряд уникальных биологических свойств плазмид способствовали их широкому применению в качестве векторных молекул.
3.1.1. Биологические свойства бактериальных плазмид
Плазмиды являются молекулярными эндосимбионтами клеток, в которых они постоянно существуют [94]. Гены природных плазмид часто берут на себя выполнение функций, которые дают преимущество клеткам-хозяевам в борьбе за существование в изменяющейся окружающей среде. Так, одна группа генов обеспечивает клеткам устойчивость к токсическим веществам (антибиотикам, ионам тяжелых металлов и т.п.), другие плаз-мидные гены кодируют белки (например, колицины), токсичные для клеток, не обладающих такими плазмидами, третьи обеспечивают прикрепление бактериальных клеток к субстрату, четвертые помогают осваивать клеткам-хозяевам новые источники углерода. В определенных условиях практически любой ген бактериальной хромосомы может быть перенесен с помощью рекомбинации в плазмиды и далее с их помощью распространиться в популяции микроорганизмов. Существование плазмид в клетках-хозяевах во многом зависит от них, однако способность к автономной репликации дает плазмидам определенную свободу от конкретного хозяина.
Таким образом, способность к автономной репликации является важнейшим биологическим свойством любой плазмиды, обеспечивающим ее независимое (в определенных пределах) существование [95]. Автономная репликация обеспечивается наличием области начала репликации, на котором происходит сборка макромолекулярного комплекса, осуществляющего инициацию и продолжение синтеза плазмидной ДНК. Для своей репликации различные плазмиды имеют разную потребность в ферментах клетки-хозяина. Так, плазмиды ColEl, используемые в качестве основы при конструировании многих векторных плазмид, для синтеза своей ДНК используют исключительно белки клетки-хозяина, в том числе ДНК-полимеразу I Е. coli на ранних стадиях репликации и ДНК-полимеразу III - на заключительных. Синтез ДНК на этих плазмидах можно моделировать с использованием бесклеточных экстрактов бесплазмидных штаммов бактериальных клеток.
Существование плазмид, не зависимое от хромосомы клетки-хозяина, невозможно без осуществления контроля числа копий
плазмидной ДНК в клетке, осуществляемого самими плазмидами [96]. Все плазмиды осуществляют негативный контроль синтеза ДНК с использованием специфических ингибиторов репликации. Одним из распространенных механизмов негативного контроля является синтез на матрице плазмидной ДНК антисмысло-вой РНК (контртранскрипта), который может быть комплементарен или мРНК белка-инициатора репликации Rep, или РНК-праймеру (в том числе, его предшественнику), необходимому для инициации синтеза плазмидной ДНК. Такой механизм функционирует у небольших плазмид типа ColEl, а также контролирует репликацию низкокопийных больших плазмид наподобие полового F-фактора [97]. Другой тип негативной регуляции репликации, обнаруженный, в частности, у плазмиды pSClOl, использует специальные регуляторные последовательности - итероны, которые представляют собой прямые повторы, расположенные вблизи области начала репликации и гена гер, кодирующего позитивный транс-действующий регулятор репликации плазмидной ДНК [98]. Итероны конкурируют с областью начала репликации за связывание Rep-белка, присутствующего в клетке в небольшом количестве, и связывают его полностью при достижении числа копий плазмиды определенного уровня, что полностью блокирует инициацию репликации. Наличие уникальных механизмов контроля числа копий плазмид в клетке обеспечивает поддержание соответствующих плазмид в клетке на уровне од-ной-двух копий (низкокопийные плазмиды) или 10-100 (плазмиды с умеренной копийностью и высококопийные плазмиды).
С учетом вышеперечисленных механизмов удалось получить мутантные миниплазмидные производные плазмиды R1 с нарушенным контролем числа копий. Такие миниплазмиды обладают температурочувствительными репликонами, которые при 30°С обеспечивают их существование в виде 20-50 копий на клетку, а при повышении температуры сверх пермиссивной и инкубации клеток на питательной среде в течение 2-3 ч количество плазмидной ДНК достигает 70% от суммарной клеточной ДНК [99]. Векторы, сконструированные на основе таких плазмид, способны обеспечивать очень высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков, гены которых клонированы с их помощью. Повышение числа внутриклеточных копий плазмид в ряде случаев может быть достигнуто и другим распространенным способом. Как уже упоминалось, репликация многих плазмид, в том числе ColEl, не требует синтеза белков, кодируемых их генами, тогда как контроль числа копий зависит от синтеза плазмидных макромолекул. Инкубация клеток, содержащих такие плазмиды, с
хлорамфениколом блокирует репликацию ДНК клетки-хозяина, но не плазмидной ДНК. Это приводит к резкому (~50-кратному) увеличению числа молекул плазмид по отношению к хромосомной ДНК, синтез которых обеспечивается предсуществующими белками бактериальной клетки.
