Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
2.2.4. Изошизомеры
В клетках разных видов бактерий могут содержаться рестриктазы, узнающие одни и те же сайты рестрикции. Они получили название изошизомеры. Эти ферменты с успехом используются для обнаружения метилированных участков ДНК в геноме. Так, рестриктазы Hhal и Hpall расщепляют неметилированные последовательности GCGC и CCGG, соответственно, и утрачивают способность к расщеплению, если хотя бы один из остатков цитозина в этих сайтах метилирован. В то же время фермент Mspl (изошизомер Hpall) расщепляет последовательность CCGG независимо от того, метилированы или неметилированы остатки цитозина в таком сайте. N-Метилирование остатков аденозина в ДНК можно обнаружить с помощью изошизомеров Sau3A (расщепляет как метилированные, так и неметилированные последовательности GATC), Dpnl (расщепляет только метилированные последовательности GMeATC) и Mbol (расщепляет только неметилированные последовательности).
Среди изошизомеров есть ферменты, которые узнают одни и те же последовательности, но разрезают их по-разному. Такие рестриктазы иногда называют гетерошизомерами. Например, рест-
риктазы Асс65\ и Крп\ узнают сайт GGTACC, разрывы в ДНК вносят следующим способом: G^GTACC и GGTACiC, соответственно, а, следовательно, создают разные липкие концы. Гетерошизомеры Smal и Xmal расщепляют ДНК с образованием тупых концов (CCClGGG) и липких - (ClCCGGG), соответственно, что позволяет по-разному клонировать одинаковые по длине фрагменты ДНК, образовавшиеся под действием этих ферментов.
2.2.5. Изменение специфичности действия рестриктаз
Влияние неоптимальных условий. Рестриктазы являются высокоспецифическими ферментами. Однако для поддержания этой специфичности in vitro необходимо соблюдать в реакционной смеси оптимальные условия для действия ферментов. При нарушении таких условий у некоторых рестриктаз начинает проявляться вторичная (так называемая штриховая) активность. В частности, рестриктаза EcoRl расщепляет последовательность GAATTC при pH 7,3, 100 мМ NaCl в присутствии 5 мМ MgCl2, однако при изменении значений pH, понижении концентрации NaCl или замене ионов Mg2+ на Мп2+, а также в присутствии органических растворителей у фермента появляется тенденция к расщеплению более короткой последовательности ААТТ (так называемая активность EcoRl* “со звездой”). К рестриктазам, обладающим подобными свойствами, относятся также эндонуклеазы BamHl, Bstl, Bsul, DdeI, Hhal, Pstl, Sail, Sstl, Xbal.
Действие рестриктаз на необычные субстраты. Помимо двухцепочечных ДНК многие рестриктазы способны использовать ДНК-РНК-гибриды в качестве субстрата. Это относится, в частности, к рестриктазам EcoRl, Hindll, Sail, Mspl, Hhal, Alul, Taql и Haelll. Некоторые рестриктазы, например, HaeIII, Hhal и Sfal, способны расщеплять оцДНК фага фХ174, хотя и со значительно меньшей скоростью, чем соответствующую двухцепочечную RF-форму. Такая способность была продемонстрирована для некоторых других рестриктаз, а также ДНК-субстратов. Остается неясным, узнают ли эти рестриктазы истинные одноцепочечные сайты или же последовательности нуклеотидов, заключенные в элементы вторичной структуры.
С развитием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см. ниже гл. 6) часто возникает необходимость расщепления ре-стриктазами амплифицированных олигонуклеотидов недалеко от их концов, т.е. в условиях, когда сайт рестрикции фланкирован с одного из своих концов одним или несколькими нуклеотидами. В этом случае установлена четкая зависимость способности
Таблица 3
Эффективность расщепления коротких последовательностей ДНК некоторыми распространенными рестриктазами [79]
Рестриктаза Последовательность Длина Процент расщепления
олигонуклеотидов цепи,нт олигонуклеотида после
в окрестностях сайта инкубации в течение
рестрикции 2ч 20 ч
BamH I CGGATCCG 8 10 25
CGGGATCCCG 10 >90 >90
CGCGGATCCCGC 12 >90 >90
Bgia CAGATCTG 8 0 0
GAAGATCTTC 10 75 >90
GGKAGATCTYCC 12 25 >90
Clal CATCGATT 8 0 0
GATCGATC 8 0 0
CCATCGATGG 10 >90 >90
CCCATCGATGGG 12 50 50
EcoRl GGAATTCC 8 >90 >90
CGGAATTCCG 10 >90 >90
CCGGAATTCCGG 12 >90 >90
Hindlll CAAGCTTG 8 0 0
CCAAGCTTGG 10 0 0
CCCAAGCTTGGG 12 10 75
Nhel GGCTAGCC 8 0 0
CGGCTAGCCG 10 10 25
CTAGCTAGCTAG 12 10 50
Pstl GCTGCAGC 8 0 0
TGCACTGCAGTGCA 14 10 10
Pvul CCGATCGG 8 0 0
ATCGATCGAT 10 10 25
TCGCGATCGCGA 12 0 10
Sacl CGAGCTCG 8 10 10
Sacll GCCGCGGC 8 0 0
TCCCCGCGGGGA 12 50 >90
Smal CCCGGG 6 10 10
CCCCGGGG 8 10 10
CCCCCGGGGG 10 0 50
TCCCCCGGGGGA 12 0 >90
Spel GACTAGTC 8 10 >90
