Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Как ДНК-полимераза I, так и ее фрагмент применяется для введения радиоактивно меченых дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем ник-трансляции, т.е. перемещения одноцепочечного разрыва вдоль молекулы дцДНК, в котором З'-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов [90]. При этом ДНК-полимераза I прокладывает себе путь с помощью 5' —> З'-экзонуклеазы, а фрагмент Клёнова вытесняет цепь ДНК с 5'-конца. Кроме того, фрагмент Клёнова используют для синтеза второй цепи кДНК, секвенирования ДНК по методу Сэнгера, заполнения 5'-выступающих липких концов ДНК с образованием тупых концов, введения концевой радиоактивной метки, а также для удаления 3'-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3' —> 5'-экзонуклеазой этого фермента. Как и ДНК-полимераза I Е. coli, Т4-ДНК-полимераза обладает 3' —> 5'- (но не 5' —> 3'-) экзонуклеазной активностью, которая у последней, по крайней мере, в 200 раз выше. Это позволяет использовать Т4-ДНК-полимеразу, в частности, для введения радиоактивной метки путем реакции обмена немеченного З'-конце-вого нуклеотида на меченный радиоактивным изотопом. Кроме того, это свойство фермента используется для получения векторов для клонирования без использования ДНК-лигазы (см. ниже раздел 3.1).
Термостабильная 7яд-ДНК-полимераза в настоящее время широко применяется для проведения ПЦР (см. главу 6.1), а ее модифицированный (мутантный) аналог, для которого характерно многократное повышение сродства к терминирующим синтез ДНК дидезоксирибонуклеозидтрифосфатам, - для секвенирования ДНК по методу Сэнгера.
2.4.2. РНК-зависимые ДНК-полимеразы
Обратные транскриптазы, иногда называемые ревертазами, способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, полимери-зуя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, как это имеет место в случае ДНК-зависимых ДНК-полимераз. Обратные транскриптазы, так же, как и ДНК-полимеразы, функционируют
только при наличии затравки. Широко используемая в генной инженерии обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц, помимо полимеризующей активности, обладает 5' —> 3'- и 3' —> 5'-экзорибонуклеазными активностями и расщепляет РНК в ДНК-РНК-гибридах по процессивному механизму, т.е. обладает активностью РНКазы Н. Кроме данного фермента для синтеза ДНК на матрице РНК часто используют обратную транскрип-тазу вируса лейкоза мышей Молони (MMLV). Обратные транс-криптазы находят применение в синтезе дцДНК, комплементарных РНК (особенно мРНК), для последующего ее клонирования в плазмидных векторах при получении клонотек кДНК (см. ниже раздел 4.1.2). Кроме того, эти ферменты, подобно ДНК-полиме-разам, могут быть использованы для введения радиоактивной или флуоресцентной метки в ДНК-зонды в составе соответствующим образом меченых дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.
Недавно способность синтезировать ДНК на матрице РНК в определенных условиях была продемонстрирована для термостабильных ДНК-полимераз Thermus thermophilus и Т. flavus. Это позволяет использовать их для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР. Современные модификации такого подхода дают возможность в одной реакционной смеси (и пробирке) синтезировать в реакции обратной транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве матрицы в обычной ПЦР (см. ниже главу 1.6).
2.5. Другие ферменты, используемые в генной инженерии
Среди других многочисленных ферментов, используемых в генной инженерии, прежде всего следует упомянуть полинуклео-тидкиназы, которые осуществляют перенос у-фосфатных групп АТР на 5'-ОН группы ДНК или РНК. Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 широко используется для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК с целью получения радиоактивно меченых зондов или секвенирования нуклеиновых кислот. Два типа реакций используется для введения концевой метки в ДНК с помощью полинуклеотидкиназы: прямая реакция, когда у-фос-фатная группа переносится ферментом непосредственно к дефо-сфорилированному 5'-концу ДНК, и реакция обмена. В последнем случае присутствие в реакционной смеси избытка ADP вынуждает полинуклеотидкиназу осуществлять перенос фосфатной
группы с 5'-конца ДНК на ADP с образованием АТР, а освободившаяся ОН-группа далее фосфорилируется у-фосфатом по обычному механизму.
Терминальная трансфераза из тимуса теленка (терминальная дезоксирибонуклеотидилтрансфераза), осуществляющая последовательное присоединение дезоксирибонуклеозидмонофосфа-тов из пула дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к З'-ОН-группам молекул ДНК, используется для введения радиоактивной метки в составе меченых нуклеотидов в 3'-концы ДНК, а также присоединения к 3'-концам фрагментов ДНК (особенно кДНК) протяженных гомополимерных последовательностей нуклеотидов (коннекторов) для последующего их клонирования.
Щелочные фосфатазы бактерий (ВАР) и кишечника теленка (CIAP) катализируют удаление 5'-фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению 5'-концевой радиоактивной метки 32Р, а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5'-концевого фосфата. Удаление 5'-концевых фосфатных групп молекул вектора, линеаризованных с помощью одной рестриктазы во время подготовки его для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репариру-ются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки. Гены секретируемых щелочных фосфатаз находят применение и в качестве высокочувствительных генов-репортеров при исследовании функционирования регуляторных элементов различных генов в прокариотических и дрожжевых системах экспрессии, а также в клетках млекопитающих [91].
