Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 24

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 221 >> Следующая

Единственным повреждением ДНК, которое является непосредственным следствием ее ферментативного метилирования, является окислительное дезаминирование 5шС с образованием урацила. Такие повреждения репарируются урацил-ДНК-глико-зилазой, которая сканирует ДНК и удаляет остатки U. Этот фермент активно используется при проведении направленного мутагенеза с целью удаления родительской цепи ДНК, в которую вместо Т исходно вводят остатки U (см. раздел 1.2.2 части II).
2.3. ДНК- и PH К-л и газы
ДНК-лигазы являются важнейшими ферментами метаболизма ДНК в живых клетках, участвующими в процессах репликации ДНК, репарации ее повреждений и рекомбинации [81-83]. Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах дц ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Реакция лигирования протекает в три этапа (рис. 5). Вначале (этап 1) образуется промежуточный конъюгат фермента с АМР, в котором остаток АМР соединяется фосфороамидной связью с остатком Lys в последовательности KXDG полипептидной цепи фермента (однобуквенное обозначение, в котором X -любой аминокислотный остаток). В зависимости от происхождения фермента донорами АМР могут быть NAD+ или АТР. После этого остаток АМР переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2) с образованием промежуточного соединения аденилат-ДНК. (АрррДНК). Возникшая фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки З'-ОН группы соседнего нуклеотида, что при-
AMP
О
О
О
Рис. 5. Механизм лигирования ДНК Т4-ДНК-лигазой
1 - образование промежуточного комплекса фермент Е-АМР; 2 - образование фосфодиэфирной связи
водит к созданию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова и освобождением АМР (этап 3).
ДНК-лигазы разделяют на два семейства в зависимости от используемого ими кофактора в качестве донора АМР [84]. АТР-за-висимые лигазы обнаруживают у бактериальных и эукариотических вирусов, архей, дрожжей, млекопитающих и эубактерий. NAD+ -зависимые ДНК-лигазы имеются почти исключительно у эубактерий. Единственное известное исключение в этом отношении составляют энтомопоксвирусы насекомых Melanoplus san-guinipes и Amsacta moorei. Наибольшее применение в генно-инже-нерных исследованиях сегодняшнего дня находит АТР-зависимая ДНК-лигаза бактериофага Т4. Т4-ДНК-лигаза осуществляет сочинение фрагментов дц ДНК, обладающих комплементарными
липкими или тупыми концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'-концевого фосфата и 3'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по тупым концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5'-фосфорилированных концов оцДНК или РНК с З'-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.
Использование ДНК-лигаз для проведения лигазной цепной реакции рассматривается в разделе 6.6.1 этой части книги [85].
2.4. Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК
К ферментам матричного синтеза нуклеиновых кислот относятся многочисленные ДНК- и РНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы, осуществляющие зависимый от матричных ДНК или РНК синтез нуклеиновых кислот. Эти ферменты обычно используются в генной инженерии для получения двухцепочечных молекул ДНК из одноцепочечных, а также для обратной транскрипции, т.е. синтеза дцДНК, комплементарных мРНК, которые называют комплементарными ДНК (кДНК).
2.4.1. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы осуществляют синтез ДНК на ДНК-матрицах в процессе репликации вирусных, бактериальных и эукариотических, митохондриальных и хлоропласт-ных ДНК, а также во время их репарации и рекомбинации in vivo [86-88]. Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-полимераза I Е. coli и ее большой фрагмент (фрагмент Клёнова [89]), Т4-ДНК-полимераза и в последнее время термостабильные ДНК-полиме-разы, особенно ДНК-полимераза Thermus aquaticus (Год-полимераза). Все эти ферменты в присутствии ионов Mg2+ из четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и ТТР) осуществляют синтез ДНК, комплементарной матричной ДНК, и для своего функционирования требуют наличия затравки на матричной оцДНК, т.е. олиго- или полидезоксирибонуклеотида со свободным З'-ОН-концом, комплементарного матричной ДНК. ДНК-полимераза IЕ. coli состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 109 к Да и обладает тремя активностями: полимеризующей в направлении 5' —> 3', 5' —> З'-экзонук-леазной и 3' —> 5'-экзонуклеазной. Кроме того, в присутствии из-
бытка неорганического пирофосфата в реакционной смеси ДНК-полимераза I может осуществлять пирофосфоролиз ДНК, т.е. реакцию, обратную полимеризации нуклеотидов. Большой фрагмент ДНК-полимеразы IЕ. coli (фрагмент Клёнова) является частью полипептидной цепи ДНК-полимеразы I с молекулярной массой около 76 кДа, у которой отсутствует домен, соответствующий 5' —> З'-экзонуклеазе.
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed