Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
a t |
5'— GGA I TCC 5' — G 5'— GATCC — 5'
in ! in i i 1
3' — CCT I AGG— 5' 3'— CCTAG— 5' q—у BamHl
! t
! t
5' — GGT I ACC — 3' 5'—GGTA — 3' CC — 3'
in !111 _ и и
3'— CCA ! TGG— 5' 3'— CC 3'— ATGG — 5' РП
t I
I
5'-
3'-
CAG
I I I
GTC
CTG ¦
I I I
GAC-
5'
3'
5'— CAG
I I I
3'— GTC
CTG — 3'
I I I
GAC— 5'
3
Pvull
BamHl 5'— G
I
3'— CCTAG — 5'
+
BgO. I 5'— GATCT — 3'
I
A— 5'
Mbol
5' —
3' —
T — 3'
A—5'
Puc. 3. Формы разрывов двухцепочечных ДНК, образующихся под действием рестриктаз
а - 5'-выступающие (1), 3'-выступающие “липкие” (2) и “тупые” (3) концы ДНК, образующиеся под действием рестриктаз BamHl, Kpnl и Pvull, соответственно. Стрелками обозначены места разрывов цепей ДНК, пунктирной линией - ось симметрии сайтов рестрикции; б - лигирование с потерей сайта рестрикции
друг другу и могут между собой взаимодействовать, их часто называют “липкими” концами. В липких концах выступающим одноцепочечным участком может быть как 5'-, так и 3'-конец (рис. 3, а). Формальным признаком образования 5'- или 3'-выступающих липких концов в сайтах рестрикции является расположение точки расщепления цепей ДНК в последовательности, используемой для обозначения сайта рестрикции, слева или справа
от оси симметрии, соответственно. У некоторых рестриктаз точки расщепления обеих цепей ДНК расположены непосредственно друг под другом в сайте рестрикции. В этом случае после расщепления ДНК липких концов не образуется, а получаются так называемые “тупые” концы, в которых нет выступающих одноцепочечных участков ДНК (см. рис. 3, а). Имеется одно принципиальное функциональное различие между 5'- и 3'-выступающими липкими концами - последние невозможно пометить путем их достройки ДНК-полимеразой. Эту особенность следует учитывать при выборе рестриктаз для получения рестрикционных фрагментов ДНК, которые предполагается использовать в качестве зондов.
При конструировании рекомбинантных молекул полезно помнить, что, хотя рестриктазы BamHl, Bell, Bglll и Xholl узнают разные сайты рестрикции, они образуют одни и те же липкие концы, GATC. То же характерно и для группы рестриктаз SalGI, Xhol и Aval (NCGA). При лигировании (см. ниже) фрагментов ДНК, образованных рестриктазами одной из таких групп, происходит их объединение, но при этом исходные сайты рестрикции теряются, так как в результате образуется новая непрерывная последовательность нуклеотидов (см. рис. 3, б).
Последовательности нуклеотидов липких концов, образующихся под действием рестриктаз типа IIS, являются уникальными для каждого такого сайта рестрикции. Вследствие этого рестрикционные фрагменты ДНК, образовавшиеся под действием данной рестриктазы, в смеси соединяются друг с другом лишь в строго определенной исходной последовательности, которая задается уникальными последовательностями нуклеотидов в липких концах рестрикционных фрагментов ДНК. Например, при расщеплении рестриктазой типа IIS репликативной формы ДНК фага фХ174 образуется 14 фрагментов, которые in vitro объединяются в правильную последовательность с образованием инфекционной фХ 174-ДНК.
2.2.3. Универсальные рестриктазы для одноцепочечных ДНК
На основе рестриктаз, узнающих асимметричные последовательности нуклеотидов, разработана система, позволяющая расщеплять молекулы одноцепочечных ДНК (оцДНК) в любой заданной точке. С этой целью синтезируется олигонуклеотид, 5'-концевая часть которого содержит сайт, узнаваемый такой рестриктазой, а последовательность нуклеотидов 3'-концевой части комплементарна участку ДНК, в который необходимо внести эндонукле-
Рис. 4. Расщепление одноцепочечной ДНК универсальной рестрикта-зой
а - синтетический олигонуклеотид; б - одноцепочечная ДНК. После образования шпильки и гибридизации с одноцепочечной ДНК-мишенью олигонуклеотид образует сайт связывания рестриктазы (участок I) и сайт расщепления ДНК-ДНК-гибрида (участок II). Стрелки указывают места эндонуклеазного расщепления ДНК и олигонуклеотида
азный разрыв. В результате гибридизации олигонуклеотида с оцДНК образуется структура, изображенная на рис. 4. При этом фермент взаимодействует с сайтом узнавания (участок I), а разрывы вносятся по местам, обозначенным стрелками. Таким образом, положение места эндонуклеазного расщепления будет целиком зависеть от последовательности нуклеотидов участка II синтетического олигонуклеотида, комплементарного ДНК-субстрату.
