Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
В заключение следует рассмотреть некоторые нуклеазы, часто используемые в генной инженерии. Нуклеазы - это гидролитические ферменты, расщепляющие фосфодиэфирные связи в нуклеиновых кислотах. По механизму расщепления субстратов нуклеазы разделяют на экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы осуществляют последовательное отщепление мононуклеотидов или небольших олигонуклеотидов с концов молекул ДНК или РНК,
3. Патрушев Л.И. Т. 1
65
тогда как эндонуклеазы вносят в молекулы нуклеиновых кислот внутренние разрывы. В частности, к эндонуклеазам относятся многочисленные рестриктазы, рассмотренные выше. Некоторые нуклеазы обладают более широкой специфичностью и могут гидролизовать как РНК, так и ДНК, а также одновременно проявлять эндо- и экзонуклеазную активности. Нуклеаза Ва1Ъ\ из Alteromonus espejina последовательно отщепляет отдельные мо-но- и олигонуклеотиды с 5'- и 3'-концов дцДНК, укорачивая обе цепи ДНК приблизительно с равной скоростью. При этом нуклеаза Ва1Ъ\ гидролизует и оцДНК.
Экзонуклеаза III Е. coli катализирует последовательное отщепление 5'-нуклеотидов из дцДНК в направлении 3' —> 5'. Фермент обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, активностью РНКазы Н (гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах) и З'-фосфатазной активностью.
Экзонуклеаза фага X. катализирует последовательное отщепление 5'-мононуклеотидов в дцДНК при наличии в них 5'-конце-вых фосфатных групп. Ее используют для получения молекул оцДНК с целью их последующего секвенирования.
Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae (35 кДа, 267 а.о.), в присутствии ионов Zn2+ специфически расщепляет молекулы оцДНК и РНК с образованием 5'-фосфорилированных моно- и олигонуклеотидов. Фермент специфически распознает и расщепляет одноцепочечные участки в одноцепочечных разрывах, брешах и петлях двухцепочечных ДНК, но не в одиночных ошибочно спаренных нуклеотидах. Те же свойства присущи и нуклеазе золотистой фасоли (mung bean), а также нуклеазе Р1 из Penicillium citrinum.
Панкреатическая рибонуклеаза А (РНКаза А) является небольшим белком (124 а.о.), который обладает активностью эндо-рибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами [92]. Продуктами гидролиза являются З'-фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3'-монофосфаты. Во многих тканях всех млекопитающих обнаружен специфический белковый ингибитор RI (450-460 а.о.), обладающий высоким сродством к РНКазе А [93].
Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и дцДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5'-фосфатные группы. В присутствии ионов Mg2+ ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически вдоль молекулы, а
в присутствии ионов Мп2+ расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга.
Рассмотренные ферменты не исчерпывают всего списка, используемого в генной инженерии. Особенности применения многих из этих ферментов для решения конкретных генно-инженер-ных задач будут еще не раз обсуждаться при дальнейшем изложении принципов генной инженерии.
Гпава 3
Векторы
Ферменты, описанные в разделе 1.2, позволяют работать как с протяженными молекулами ДНК, так и с их фрагментами. Однако с использованием только этих ферментов еще нельзя решить одну из основных методических задач молекулярной генетики - выделение любой требуемой нуклеотидной последовательности в чистом виде и в количестве, достаточном для исследования этих последовательностей биохимическими методами. Исключение составляет метод ПЦР, однако его применение ограничивается короткими последовательностями нуклеотидов.
Основная идея, позволяющая решать эту задачу, заключается в том, чтобы присоединить исследуемые фрагменты ДНК к молекуле-переносчику, которая могла бы автономно существовать внутри бактериальных или эукариотических клеток в виде одной или нескольких копий и передаваться вместе со встроенным в нее фрагментом ДНК от одной клетки к другой. Такие молекулы-переносчики фрагментов нуклеиновых кислот были созданы, их называют векторами, и они являются одним из важнейших инструментов генной инженерии.
Идеальная векторная молекула должна обладать несколькими обязательными свойствами. Во-первых, любой вектор должен длительное время существовать в популяции клеток-хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток. Во-вторых, в любом векторе должны быть биохимические или генетические маркеры, которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках. В-третьих, структура векторной молекулы должна допускать встраивание в нее чужеродной последовательности нуклеотидов без нарушения ее функциональной целостности. Для конструирования векторов в генной инженерии используют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, способные к автономной репликации в бактериальных и эукариотических клетках - плазмиды и эписомы, хромосомы вирусов, а также фрагменты хромосом эукариотических клеток.
