Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
1.1. Проектирование новых белков и ферментов
1.1.1. Энергетические требования, предъявляемые к новой белковой конструкции
В процессе биосинтеза или по его завершению линейная молекула полипептида должна свернуться правильным образом с образованием нативной пространственной структуры, необходимой для ее функционирования. Процесс сворачивания (фолдинга) полипептидной цепи может происходить как самопроизвольно, так и с участием белков-помощников - шаперонов. В соответствии с современными моделями, высококооперативный процесс фолдинга полипептидных цепей происходит по механизму нукле-
ации, т.е. начинается с формирования ядер фолдинга, в котором участвует небольшое количество аминокислотных остатков, вокруг которых начинают формироваться другие внутримолекулярные взаимодействия [8].
Теоретически разработанная полипептидная цепь будет приобретать в процессе фолдинга уникальную правильную пространственную структуру, если она будет удовлетворять, по крайней мере, двум требованиям [9]. Во-первых, цепь должна содержать позитивные элементы, стабилизирующие ее правильную третичную структуру. Различия в свободной энергии поли-пептидных цепей природных белков в правильной конформации и денатурированном состоянии достигают значений 4-10 ккал/моль. Во-вторых, полипептидные цепи должны заключать в себе элементы негативного дизайна для создания большого энергетического разрыва между нативным состоянием молекулы и другой возможной конформацией. В противном случае, в процессе сворачивания полипептидной цепи белок вместо единственной правильной конформации будет предпочтительно формировать альтернативные элементы вторичной структуры, организованные в глобулы. Таким образом, для успешного дизайна белка требуются не только стабилизация его пространственной структуры в функциональном состоянии, но и дестабилизация всех возможных альтернативных элементов вторичной структуры, которые иначе будут служить кинетическими и энергетическими ловушками на пути реализации правильного фолдинга. Действительно, уже в ранних экспериментах по белковому дизайну de novo было установлено, что для успешного завершения работы необходимо предвидеть и с помощью негативного дизайна нейтрализовать как можно больше альтернативных внутримолекулярных структур, обладающих низкой свободной энергией.
Информация, требуемая для правильного фолдинга полипептидной цепи, распределена вдоль нее в последовательности аминокислотных остатков и реализуется в сети многочисленных внутримолекулярных полярных и гидрофобных взаимодействий, каждое из которых вносит в данный процесс свой энергетический вклад. При этом наиболее важное влияние оказывают аминокислотные остатки, расположенные внутри белковой глобулы, и бывает трудно оценить роль отдельных аминокислотных остатков в определении пространственной структуры белка. В идеальном случае рациональный дизайн белков должен учитывать совокупность всех этих взаимодействий.
1.1.2. Выбор пространственной структуры
При реализации структурного подхода в дизайне белков работа начинается с построения трехмерной модели полипептидного скелета макромолекулы. При дизайне de novo такие координаты атомов должны быть получены путем математических расчетов. Компьютерный дизайн совершенно новых белков начинают с определения координат скелета полипептидной цепи и построения схемы силовых полей, взаимодействующих в макромолекуле. Альтернативно скелет белка может быть построен с использованием клонотеки известных элементов вторичных структур. В том случае, если целью исследования является редизайн природного белка, при построении модели используют координаты атомов исходной макромолекулы, предварительно полученные с помощью рентгеноструктурного анализа или ЯМР-спектроскопии.
1.1.3. Комбинаторная проблема обратного дизайна белков
После выбора конформации скелета создаваемого белка переходят к следующему этапу конструирования - так называемому обратному дизайну: определению последовательности аминокислотных остатков, которая может свернуться в требуемую пространственную структуру. Полный набор случайных последовательностей, который можно получить для 100-звенного полипептида из 20 разных аминокислотных остатков, представлен 10130 последовательностями. Учитывая большое влияние на фолдинг гидрофобных и полярных аминокислотных остатков, прежде всего занимаются их распределением вдоль полипептидной цепи. Введение только пяти таких остатков позволяет ограничить пространство последовательностей в 1060 раз. Но даже в этом случае число оставшихся вариантов является слишком большим (1070).
Имеется несколько путей снижения остроты этой проблемы. Во-первых, известно, что большое число последовательностей может приобретать одну и ту же пространственную структуру, что дает возможность рассматривать не все возможные последовательности, а лишь одну из многих. Во-вторых, при конструировании последовательности можно использовать не все 20 аминокислот, а значительно меньшее количество. Водородные связи и электростатические взаимодействия между боковыми цепями аминокислотных остатков, погруженных в белковую глобулу, играют большую роль в формировании пространственной структуры белка. Поэтому расчет возможных взаимодействий внутри белковой глобулы с использованием специальных алгоритмов помогает осуществить выбор оптимальной последовательности из
