Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
многочисленных возможных, а одной из основных задач является разработка эффективных алгоритмов, позволяющих находить оптимальные решения данной проблемы.
1.1.4. Дизайн поверхности белковой глобулы
Менее четверти боковых цепей аминокислотных остатков находится внутри белковой глобулы вне контакта с растворителем. Остальные 75% остатков помогают стабилизировать основную пространственную структуру белка и дестабилизировать возможные альтернативные состояния. В настоящее время создано программное обеспечение, позволяющее автоматизировать процесс разработки участков полипептидных цепей, которые взаимодействуют с растворителем. В результате его использования удается предсказывать стабильность а-спиральных участков белка, контактирующих с водной фазой, и характер взаимодействия соседних групп в этих последовательностях.
1.1.5. Примеры использования методов рационального дизайна
С помощью дизайна de novo пока удается конструировать элементы вторичной структуры белков или их отдельные домены [9]. Гораздо более успешными оказываются попытки осуществлять рациональный редизайн известных белков, используя в качестве исходных молекул белки и ферменты, функциональность которых уже была апробирована самой природой в живых организмах. Одним из подходов в этом случае является создание новых активных центров в белках, пространственная структура которых хорошо изучена.
Создание нового активного центра в молекуле тиоредоксина. Недавно при использовании в качестве исходной молекулы инертного белка тиоредоксина после проведения предварительного компьютерного дизайна удалось внедрить в его полипептид-ную цепь новый активный центр, способный осуществлять гидролиз активированных эфиров [10]. В этом случае для решения проблемы были использованы знания, накопленные при исследовании механизмов функционирования каталитических антител (абзимов). Была создана серия виртуальных модифицированных молекул тиоредоксина с минимальной общей свободной энергией. Требуемое высокоэнергетическое состояние конкретных молекулярных участников реакции моделировали с помощью боковых цепей аминокислотных остатков, ориентированных в пространстве с целью создания условий, необходимых для осуществления катализа (реакция а). На рисунке справа (б) изображена схе-
О
II
Rj-0 R2 + His
I
II
С
Ri-0/40-R2
в
О
II
р
/л
От
I
Ri-0 I O-Ri
His
J
1
Q
Or
О
II
R1-0T0-R2
OH
Ri“OH+ p—R2 His
o-
Rj-OH + C02 + OH-R2
ма той же самой реакции, включающая гипотетическое промежуточное соединение в переходном состоянии, аналог которого
(в) был использован для иммунизации животных при получении абзимов (об абзимах подробнее см. ниже раздел 3.4.3).
Был получен набор (клонотека) вариантов, по-разному ориентированных в пространстве боковых цепей (ротамеров), находящихся в высокоэнергетическом состоянии, которые размещали в различных участках полипептидной цепи тиоредоксина таким образом, чтобы они сохраняли способность взаимодействовать с субстратом. (Ротамерами называют статистически значимые конформации боковых цепей аминокислотных остатков в составе полипептидной цепи). Путем теоретической оценки способности предполагаемых активных центров, сформированных в разных участках полипептидной цепи, взаимодействовать с субстратом удалось предсказать несколько “протозимов”, потенциально способных осуществлять соответствующую реакцию. Экспериментальное исследование показало, что, действительно, такие белки гидролизовали эфир по механизму нуклеофильного катализа с участием остатка His. Хотя удельная активность подобных искусственных ферментов была умеренной (на уровне абзимов первого поколения), сам подход представляется весьма перспективным, так как его реализация может способствовать созданию искусственных ферментов, катализирующих реакции, которые не происходят в природе.
Конструирование новых металлоферментов. В настоящее время достаточно хорошо изучены механизмы реакций, осуществляемых ферментами, которые содержат в своем активном Центре ионы металлов (металлоферментами). Перед началом работ по конструированию искусственных металлоферментов
уже имелся метод компьютерного предсказания участков поли-пептидных цепей, способных образовывать комплексы с ионами металлов [11]. На основе этого подхода опять-таки в молекуле тиоредоксина были смоделированы центры связывания ионов металлов в комплексе с молекулой кислорода [12]. Многие из таких искусственно созданных белков обладали способностью связывать ионы металлов и осуществлять реакции с участием молекулярного кислорода.
1.1.6. Ландшафт функциональности среди пространства
последовательностей белковых молекул
Переходя к обсуждению результатов по созданию белков и ферментов с новыми функциями, которые удается получать методами рационального дизайна в белковой инженерии, необходимо сформулировать два важных понятия, которые часто используются в молекулярной генетике. Совокупность всех возможных последовательностей аминокислотных остатков полипептидной цепи (или полинуклеотида) определенной длины составляет ее полное пространство последовательностей (sequence space). Например, полное пространство последовательностей 100-звенной полипептидной цепи, построенной из 20 природных аминокислотных остатков, будет представлено 20100 (~10130) последовательностями. Хотя полное пространство последовательностей является ft-мерным и его невозможно изобразить графически, для удобства обсуждения его часто изображают в виде двумерной плоскости, где каждая точка плоскости соответствует индивидуальной последовательности этого пространства (рис. 31).
