Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Подход, получивший название направленной эволюции белковых молекул, не требует досконального знания особенностей строения и функционирования создаваемых белковых молекул [5-7]. В основе этого экспериментального направления исследований лежат идеи, хорошо известные в эволюционной биологии. Для осуществления направленной эволюции белков в условиях лаборатории создают большие клонотеки случайных аминокислотных последовательностей, из которых вначале тем или иным
методом отбирают полипептидные цепи, обладающие хотя бы в небольшой степени требуемыми свойствами. Далее на основе найденных последовательностей с использованием случайного мутагенеза получают новые клонотеки белков, которые применяют в следующем раунде селекции, и так далее. При осуществлении направленной эволюции используют генно-инженерные конструкции, экспрессирующие исследуемые белки, которые остаются физически связанными с отбираемыми белками, например, в составе фаговой частицы или в комплексе с кодирующей белок мРНК. Следовательно, в таких искусственных генетических системах генотип оказывается однозначно связанным с фенотипом, что позволяет через генотип, изменяемый направленным или случайным мутагенезом, оказывать влияние на фенотип белковой молекулы и отбирать полипептиды, обладающие необходимыми свойствами. Использование методов направленной эволюции позволило добиться выдающихся результатов в белковой инженерии, часть из которых будет рассмотрена ниже.
Исследователи, работающие в области направленной эволюции, изначально используют клонотеки последовательностей, которые, несмотря на случайный характер их создания, охватывают лишь небольшую часть теоретически возможного пространства последовательностей, представляющего набор молекул с аминокислотными остатками (или нуклеотидами) во всевозможных сочетаниях. Поскольку такие клонотеки получают руками экспериментатора, то с их помощью можно конструировать макромолекулы, не встречающиеся в природных условиях. Однако размер полного пространства последовательностей слишком велик, чтобы с ним можно было работать экспериментально. Поэтому в белковой инженерии на практике часто реализуют компромиссный вариант подхода, в котором в качестве исходной последовательности при конструировании нового фермента используют известную последовательность с исследованной пространственной структурой, функциональность которой уже была апробирована в природе. В этом случае на основе имеющихся знаний о структуре и механизмах функционирования активного центра исходного фермента с помощью направленного мутагенеза заменяют конкретные аминокислотные остатки в надежде получить фермент с требуемыми свойствами. Такой подход получил название рационального редизайна. Одним из плодотворных подходов в этом направлении исследований является инженерия белковых поверхностей (patch engineering), при котором с помощью мутаций изменяют участки полипептидной цепи в окрестностях аминокислотных остатков, сближенных на поверхно-
сти белковой глобулы, но находящихся в полипептидной цепи на значительном расстоянии друг от друга.
Поскольку большинство изменений аминокислотных остатков в составе полипептидных цепей проводится в искусственных генетических системах с использованием направленного или случайного мутагенеза, целесообразно в конце этого краткого введения вспомнить типы мутаций и их основные характеристики.
Мутации, мутагенез и их последствия для белковых молекул.
Мутации - это наследуемые изменения структуры генома, а следовательно и генов, представляющих его существенную часть. Поскольку основу любого генома составляют нуклеиновые кислоты - ДНК или РНК, то под действием мутаций происходит, прежде всего, изменение структуры геномных нуклеиновых кислот. Процесс возникновения мутаций, основанный на различных механизмах, называют мутагенезом. В зависимости от факторов, вызывающих мутации, последние принято разделять на спонтанные и индуцированные. Считается, что спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении всей жизни организма в нормальных для него условиях окружающей среды. При этом широкое распространение получило мнение о том, что спонтанные мутации в эукариотических клетках возникают с частотой 10-9—10~12 на нуклеотид за клеточную генерацию. Теперь, однако, становится ясно, что такие цифры не отражают реальности. Они не учитывают того факта, что частоты спонтанных мутаций могут существенно (на несколько порядков) изменяться от локуса к локусу и, скорее всего, указывают на нижний предел частоты мутаций в отдельных наиболее стабильных участках генома.
Индуцированными мутациями называют наследуемые изменения генома, возникающие в результате тех или иных мутагенных воздействий в искусственных (экспериментальных) условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды. Среди важнейших мутагенных факторов, прежде всего, необходимо отметить химические мутагены - органические и неорганические вещества, вызывающие мутации, а также ионизирующее излучение. При детальном рассмотрении спонтанных и индуцированных мутаций становится ясно, что между этими двумя типами нет существенных различий. Действительно, большинство спонтанных мутаций возникает в результате мутагенного воздействия, которое их индуцирует, но не регистрируется экспериментатором. На более прочном фундаменте находится классификация
