Кроветворная и лимфоидная ткань - Лурия Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
До последнего времени не было получено убедительных результатов, которые свидетельствовали бы о возможности сколько-нибудь длительного поддержания, а тем более размножения стволовых кроветворных клеток в культурах. Это относится к попыткам культивировать кроветворные клетки в монослойных и суспензионных культурах.
Попытка лечения облученных животных введением фибробластов из длительных монослойных культур костного мозга впервые была предпринята Мак Куллоком и Паркером (1957). Мышам, облученным в дозе 400 р, внутривенно вводили клетки из культур костного мозга, в результате чего выживало 20% реципиентов, в то время как в нелеченом контроле-—5%. Однако использованная модель является неудачной для оценки защитного потенциала клеток из культур, так как доза облучения была слишком мала и не
обеспечивала 100% гибели контрольных животных. Возрастание процента выживших реципиентов можно объяснить не непосредственным участием в кроветворении введенных клеток, а их стимулирующим влиянием на регенерацию собственной кроветворной ткани реципиентов.
В другом исследовании (Monit, Sato, 1967) клетки селезенки молодых мышей культивировали 4 дня на среде с добавлением 15% лошадиной и 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки. Через 4 дня клетки из культур в количестве 1,5 X107 вводили внутривенно летально облученным син-генным мышам и этим обеспечивали их защиту. Данная работа доказывает, что ;в течение 4 дней стволовые клетки могут действительно сохраняться in vitro и что после пребывания в облученном организме снова могут быть подвергнуты культивированию в течение следующих 4 дней и т. д. Однако эти результаты не свидетельствуют о сохранении стволовых клеток вне организма более 4 дней.
О том, что костный мозг из суспензионных культур после нескольких дней культивирования может защищать облученного реципиента, свидетельствуют и результаты Billen (1957). Суспензия клеток костного мозга мышей культивировалась по методу Osgood, Brownlee. СингенНым мы-шам-реципиентам, облученным в Дозе 900 р, внутривенно вводили по 0,5—2 XIО6 клеток из культур. Выживание значительной части реципиентов наблюдалось при введении им клеток, культивируемых в суспензионных культурах в течение 4 — 7 дней. При более длительном культивировании костного мозга его защитный потенциал резко падал.
Костный мозг, эксплантированный по методу Рейснера, не обеспечивал лучшей защиты облученных мышей, чем костный мозг из суспензионных культур. Так, при введении клеток из 4-дневных культур наблюдалось 100% выживание реципиентов, облученных в дозе 900 р. На 6-й день культивирования костный мозг обеспечивал лишь 18—44% выживание облученных мышей, а при более длительном пребывании в культурах он полностью утрачивал свои защитные свойства (Billen, 1959).
В процессе культивирования происходило замещение юных форм более зрелыми. Так, в исходной клеточной суспензии количество миелобластов и миелоцитов составляло 14%, через 4 дня культивирования— 10%, а на 9-й день — 6%, в то же время процент зрелых гранулоцитов нарастал. На 9-й день культивирования макрофаги, фибробласты
и неидентифицированные элементы составляли 69%, в то время как в исходном материале на их долю приходилось 2% (Billen, 1959).
Таким образом, культуры костного мозга оказывали защитный эффект на облученного реципиента до тех пор, пока в них продолжалось кроветворение. При переходе моно-слойных и суспензионных культур во вторую фазу роста (макрофагальную) клетки из культур уже не защищали облученных реципиентов.
В агаровых культурах костного мозга миелоидное кроветворение поддерживается в течение 10—14 дней. При этом показано, что развитие колоний миелоидных клеток обусловлено пролиферацией и дифференцировкой коммити-рованных предшественников миелоидного ряда дифференцировки; количество таких предшественников при культивировании кроветворных клеток на фидере из клеток эмбриональной почки в течение 1—2 суток даже возрастает по сравнению с исходным, а затем начинает падать и к концу 4-х суток в культурах практически не содержится предшественников, способных дать начало новым колониям при пересеве на свежую питательную среду (McCulloch, Till,
1971).
Возникает вопрос: сохраняются ли в данной системе стволовые кроветворные клетки и если сохраняются, то в течение какого времени и в каком состоянии? Метод эксплантации кроветворных клеток в агаре создает трудности для проведения опытов по обратной трансплантации в организм (Metcalf, 1969). Эти трудности удается преодолеть, используя для культивирования модификацию метода агаровых культур, предложенную Worton и др. (1969). Клетки костного мозга, суспендированные в жидкой питательной среде с 10% сыворотки (и не содержащей агар), помещаются над слоем 0,5% агара, в который вводятся клетки фидера либо кондиционированная среда. Клетки костного мозга при этом находятся в одно и то же время как бы и в агаровых и суспензионных культурах. Вместе со слоем жидкой питательной среды их легко извлечь из культурального сосуда, затем отмыть и ввести внутривенно облученному реципиенту. Оказалось, что количество стволовых (колониеобразующих) клеток как при культивировании на фидере, так и в присутствии кондиционированной среды в течение первых суток после эксплантации резко падает. Однако в культурах на фидере на 2-е сутки оно составляет большую величину (25%), чем в культурах на кондициони-
