Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
7.5. Инкубация и перфузия
I. Установите чашки Петри, содержащие по две культуральные камеры, на лотки из нержавеющей стали и разместите их в анаэробном сосуде Макинтоша и Филдса (Bairdand Tatlock Ltd., London, UK) (рис. 7.8), модифицированном Фэйнстатом [47]. Из сосуда удалены средства анаэробного контроля, и крышка снабжена двумя вентилями.
II. Поместите сосуд в термостат и соедините с газовым баллоном с помощью силиконовой трубки, проходящей через небольшое отверстие в верхней части термостата.
III. Пропускайте через сосуд смесь 5% СОг и 95% кислорода, используя стерильный фильтр. При культивировании предстательной железы взрослых животных продувание газовой смесью продолжайте в течение 25 мин со скоростью 150 мл/мин. При культивировании трахей новорожденных и кожи продувайте смесь 20 мин со скоростью 125 мл/мин. Контролируйте скорость протока газовой смеси и ее состав с помощью специального измерителя.
IV. Плотно закупорьте сосуд, так чтобы концентрация газовой смеси внутри оставалась постоянной вплоть до открывания сосуда при смене среды.
V. Инкубируйте культуры при 37,5 °С.
Смесь 5% СОг и 95% кислорода оказалась пригодной для культивирования предстательных желез, трахей и кожи; появление центральных некрозов, которые могут возникнуть при культивировании в атмосфере воздуха, предотвращается. Одна-
Входная труьна _______
для подачи газа 1—
Винт, прижимающий крышку сосуда
Вых-одкой газовый вентиль
Крышна
камеры
Энсплантат
Боросилинатные
культуральные
чашни
Жидкая
культуральная
среда
Увлажнитель
Чашка Петри
Столик из стальной сетки
Уплотнительное
резиновое
кольцо
Лотон для культуральных
Рис. 7.8. Модифицированный анаэробный сосуд Макинтоша и Филдса для создания газовой фазы культуры.
ко при культивировании других тканей более низкое содержание кислорода (но превышающее его концентрацию в воздухе) может оказаться столь же эффективным.
7.6. Смена среды
Среда меняется каждые 2—3 дня.
I. Выньте из сосуда Макинтоша чашки Петри с культурами.
II. Пастеровскими пипетками отсосите старую среду из чашек и замените ее на такое же количество новой среды.
Культуральные камеры должны оставаться в тех же чашках Петри, если период культивирования относительно
короток. При более длительном культивировании рекомендуется переносить камеры в новый набор стерильных чашек Петри, увлажненных стерилизованной водой или раствором Хэнкса.
III. После смены среды вновь поставьте чашки Петри с культуральными камерами в сосуд Макинтоша.
IV. Сосуд опять должен быть плотно закрыт и продут тон же газовой смесью, что и раньше.
Техника сеток нашла успешное применение при изучении роста и дифференцировки эмбриональных и взрослых тканей, действия стероидных гормонов на их органы-мишени и взаимодействия канцерогенов и конденсата табачного дыма с витамином А.
Исследования культивируемых предстательных желез крыс показали, что этот орган остается андроген-зависимым, отвечающим на гормон in vitro, и что в этих условиях ткань может метаболизировать тестостерон до активного андрогена (дигидротестостерона). Это было показано с помощью хроматографического анализа стероидов ткани и культуральной среды [48]. В органной культуре может хорошо поддерживаться доброкачественная гиперплазия предстательной железы человека [49]; было показано, что тестостерон стимулирует синтез РНК в эпителии и строме эксплантата [50]. Использование техники сеток позволило культивировать в течение длительного периода мочевой пузырь крысы и человека; при этом было показано, что уротелий дифференцируется in vitro таким же способом, как и in vivo [51, 52].
В предстательных железах мышей и крыс, эмбриональных легких мыши и человека и трахеях плодов и новорожденных крыс канцерогенные углеводороды и конденсат табачного дыма при кратковременном воздействии индуцировали предраковые изменения. Этот эффект мог быть подавлен витамином А и его структурными аналогами [53—56].
8. Длительное культивирование взрослых тканей человека
Многие методы органной культуры обеспечивают рост и дифференцировку эксплантированного органа in vitro только в течение ограниченного периода времени. Часто решение какой-либо проблемы может быть достигнуто в течение дней или недель культивирования, но в других случаях требуется более долгий период поддержания органной культуры. Такая необходимость возникает, в частности, при изучении канцерогенеза тканей человека, требующего длительного воздействия канцерогенных агентов.
Исходя*из этих задач, был разработан метод культивирования, согласно которому ткань человека попеременно подвергается воздействию жидкой среды и соответствующей газовой фазы. С помощью этого метода можно поддерживать рост и дифференцировку ткани в культуре в течение продолжительного времени.
Такой метод был использован для культивирования бронхов [20], молочной железы [21], пищевода [22] и шейки матки [23].
8.1. Эксплантация и культивирование
