Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 91

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 136 >> Следующая

Метод был также применен к изучению роста опухолей. Вольфф с сотрудниками [41] добились роста опухолевых клеток человека из перевиваемых линий, а также из свежих опухолей на агаровом геле, ассоциированном с мезонефросом кур, или на геле, содержащем диализат печени кур.
Этот метод все еще находит широкое применение, хотя состав агарового геля претерпел значительные изменения и многие авторы для растворения агара используют не солевые растворы, а химически определенные среды.
В разд. 5.1 приведена модификация метода, использующая такую определенную среду.
5.1. Техника эмбриологических часовых стекол
5.1.1. Материалы
Эмбриологические часовые стекла с внешним диаметром 3,9 см и внутренним диаметром 3,5 см (рис. 7.5).
Стеклянные крышки диаметром 3,9 см для покрывания часовых стекол.
Парафин, прогретый до 60 °С, для приклеивания крышки к часовому стеклу.
Маленькая кисточка из натуральной щетины для смазывания крышки парафином.
2%-ный агар Гибко.
Среда 199 Моргана, Мортона и Паркера на солевом растворе Хэнкса (двукратная).
Среда 199 (однократная) на растворе Хэнкса.
Эмбриональная сыворотка или сыворотка новорожденных телят, инактивированная при 56 °С в течение 30 мин.
Раствор Хэнкса.
Пастеровские пипетки.
Зксплантат Сгусток агара
Рис. 7.5. Эмбриологическое часовое стекло с агаровым сгустком. Вольфф
и Хаффен, 1952 [12].
Пипетки с широким кончиком.
Капиллярные пипетки, получаемые путем оттягивания кончиков пастеровских пипеток над пламенем.
Держатель пипеток.
Катарактные ножи.
Часовые пинцеты, изогнутые тонкие ножницы, анатомические иглы.
Стеклянные пластинки с площадью поверхности около 8 см2 для препарирования органов.
5.1.2. Приготовление агарового геля
I. Нагрейте 2%-ный агар в водяной бане при 90°С до разжижения и затем быстро смешайте в стеклянной пробирке с равным объемом двукратной среды 199. Храните полученный агар при 37°С.
II. После перемешивания поместите 0,5 мл 1%-ного агара на дно часового стекла, добавьте 0,1 мл эмбриональной сыворотки или сыворотки новорожденных телят и 0,4 мл среды, 199. Быстро и тщательно перемешайте, избегая преждевременного сгущения. Образование геля в смеси начинается при 36 °С и окончательное затвердевание — при 30 °С.
При необходимости получения меиынего количества геля пропорции агара, сыворотки и среды 199 должны сохраняться.
В экспериментах, направленных на изучение действия гормонов или других агентов, эти вещества должны вводиться в гель путем растворения их в однократной среде 199.
5.1.3. Эксплантация
I. Отделите от эмбрионов органы или зачатки органов, используя бинокулярную лупу. В ходе препарирования поддерживайте влажность эмбрионов с помощью раствора Хэнкса, содержащего 2% сыворотки.
II. Перенесите предназначенные для культивирования ткани в лунку предметного стекла и промойте их раствором Хэнкса.
III. Перенесите ткани на агаровый гель с помощью двух катар актных ножей или путем осторожного отсасывания раствора Хэнкса с кусочками ткани в пипетку с широким носиком н нанесения на гель.
IV. С помощью двух анатомических игл сориентируйте эксплантаты на агаре и отсосите избыток жидкости капиллярной пипеткой. Обычно на каждом геле устанавливается по одному эксплантату. Оптимальный размер эксплантата
1,5X1,5X10 мм, а максимальный размер 2Х2Х1>5 мм. Однако, если ткань очень тонкая (тоньше 0,5 мм), размеры эксплантата могут быть больше.
V. С помощью тонкой кисточки наклейте стеклянную крышку на камеру, используя по крайней мере 2 слоя теплого парафина (60 °С). Перенесите камеры в термостат и инкубируйте при 37 °С или другой заданной температуре. Желательно не ставить камеры непосредственно на металлические полки, а использовать деревянные прокладки.
Многие эксперименты, связанные с изучением морфогенетических изменений и дифференцировки клеток, не требуют длительного культивирования, и ответы на поставленные вопросы могут быть получены в течение 3—7 дней. В этих случаях можно не менять среду. Если эксперимент требует более продолжительного культивирования, то следует переносить эксплантаты на свежий агаровый гель каждые 5—7 сут. Свежий гель делается в новой камере при соблюдении тех же пропорций агара, сыворотки и среды.
Удалите крышку с эмбриологического часового стекла старой культуры, используя прогретые бритву или скальпель. Снимите эксплантаты со старого геля, применяя два катарактных кожа или катарактный нож и анатомическую иглу, и промойте эксплантаты раствором Хэнкса в лунке предметного стекла. Перенесите эксплантаты на новые гели и заклейте часовые стекла свежими стерилизованными стеклянными крышками, используя маленькую кисточку и парафин.
Жизнеспособность эксплантатов и макроскопические изменения можно контролировать, просматривая препараты при дневном свете или с помощью источника света от бинокулярной лупы. Здоровые и растущие ткани обычно кажутся прозрачными, поверхность их выглядит блестящей. Наличие затенений свидетельствует о потере жизнеспособности или о начинающихся в тканях некрозах.
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed