Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Модификация, при которой солевой раствор был заменен химически определенной средой, дала возможность изучать индукцию тестостероном развития предстательной железы из урогенитального синуса в эмбрионах мышей и крыс и роль мезенхимы в этом процессе [42, 43]. Агар обеспечивает развитие предстательной железы из целого синуса и из его компонентов (эпителия и мезенхимы), разделенных и реассоциированных друг с другом в различных сочетаниях.
6. Культура эмбрионов для тератологических исследований
Нью [44, 45] и Кокрофт [46] разработали метод, позволяющий выращивать в культуре целых эмбрионов мышей и крыс. Эмбрионы на ранних преимплантационных стадиях развития более пригодны к культивированию in vitro, чем эмбрионы поздних сроков [44]; последние, однако, больше подходят для проведения тератологических исследований, поскольку они чувствительнее к токсическим агентам.
В соответствии с этим Нью и Кокрофт выбрали эмбрионы на двух последних стадиях беременности: 9,5 сут и 11,5 сут. Девяти суточные эмбрионы состоят из пресомитного цилиндра длиной 1,5 мм и диаметром 0,6 мм. Эмбрионы в возрасте
11,5 сут содержат 27—31 сомитов и имеют длину 3—3,8 мм.
6.1. Получение эксплантатов
Удалите матку беременного животного, поместите в солевой раствор и откройте ее с анти-мезометриальной стороны. Изъятие плода осуществляйте с помощью катарактного ножа. После переноса в свежий раствор удалите материнскую децидуальную оболочку и вскройте мембрану Рейхерта. Эктопла-центарный конус или аллантоис у более взрослых эмбрионов остаются’связанными с эмбрионами, которые теперь готовы к помещению в культуральные камеры.
Используются два типа культуральных камер.
I. Цилиндрические бутыли на 60 мл. Они частично заполняются средой и газовой смесью. Бутыли укладывают горизонтально на роллеры и вращают со скоростью 30—60 об/мин.
В ходе инкубации эмбрионы максимально доступны и среде, и растворенным в ней агентам.
II. Ротатор. Небольшие культуральные сосуды прикрепляются к полому вращающемуся барабану, через который постоянно пропускают газовую смесь. Это обеспечивает постоянство содержания С02 и кислорода при минимальных изменениях pH среды.
6.2. Газовая смесь
Для эмбрионов в возрасте 9,5 сут в течение первых 24 ч культивирования наиболее пригодна газовая смесь, состоящая из 5% С02, 5% 02 и 90% N2. При последующем культивировании газовая смесь должна содержать 5% С02, 20% 02
и 75% N2.
Для эмбрионов в возрасте 11,5 сут пригодна газовая смесь из 5% С02 и 95% 02 в течение всего периода культивирования.
6.3. Среда
В качестве среды используется сыворотка крыс, получаемая от доноров под эфирной анестезией. Результаты оказываются лучше, если кровь центрифугировать немедленно после выделения и до формирования сгустка. Образующийся в супернатанте сгусток слегка отжимают для высвобождения попавшей в него сыворотки. После повторного центрифугирования сыворотку собирают и хранят при —10 °С. Перед использованием сыворотку размораживают, инактивируют при 56 °С в течение 30 мин; через нее продувают воздух для удаления остаточного эфира и центрифугируют для удаления вновь образованных сгустков фибрина.
6.4. Схема эксплантации
Шесть эмбрионов в возрасте 9,5 сут помещают в бутыль объемом 60 мл с 6 мл сыворотки. Три эмбриона в возрасте
11,5 сут помещают в бутыль с 9 мл сыворотки и оба типа эмбрионов инкубируют при 37—38 °С. Эксплантированные эмбрионы свободно плавают в сыворотке или помещаются на покрытую коллагеном ткань, прикрепленную к покровному стеклу.
Значительная часть эмбрионов хорошо развивается в культуре. Более молодые эмбрионы образуют 25—28 сомитов, и содержание в них белка увеличивается; характер этих изменений близок к таковому, наблюдаемому при развитии in vivo. Эмбрионы в возрасте 11,5 сут развиваются несколько медленнее,
чем in vivo, но и в них количество сомитов увеличивается и содержание белка также повышается. Закрепленные эмбрионы можно наблюдать в ходе культивирования, следить за их развитием, а также исследовать влияние токсических агентов на нормальное развитие эмбрионов. Этим методом было успешно изучено влияние СОг, избытка глюкозы и гипертермии [46]. Метод в равной степени пригоден для изучения влияния и других веществ на развитие эмбрионов.
7. Техника сеток
Этот метод сочетает использование жидкой химически определенной или полуопределенной среды с твердой опорой экс-плантироваиной ткани, предотвращающей ее погружение в среду, приводящее к кислородной недостаточности. Важность кислорода для роста взрослых тканей была выявлена Троувеллом,
Миллипоровый
фильтр
Рис. 7.6. Модифицированный метод Троувелла.
создавшим аппарат, в котором культивируемый эксплантат на сетке заключается в камеру с атмосферой двуокиси углерода и кислорода [17—19]. Использование металлической сетки для поддержания культур в жидкой среде сохранилось до настоящего времени, но исходная газовая камера, предложенная Троувеллом, претерпела существенные модификации и упрощения.
